Editor-in-Chief Hatice Kübra Elçioğlu Vice Editors Levent Kabasakal Esra Tatar Online ISSN 2630-6344 Publisher Marmara University Frequency Bimonthly (Six issues / year) Abbreviation J.Res.Pharm. Former Name Marmara Pharmaceutical Journal
Journal of Research in Pharmacy 2011 , Vol 15 , Num 2
The effect of centrally and peripherally administered oxytocin on increased anxiety and pain perception in rats with burn injury
Gülsün Memi1, Zarife Nigar Özdemir1, İpek Azizoğlu3, Fatma Darıcı3, Tuba Kaya3, Tuba Özdil3, Feriha Ercan2, Berrak Ç. Yeğen1
1Marmara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Fizyoloji ABD., İstanbul, Türkiye
2Marmara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji ABD, İstanbul, Türkiye
3Marmara Üniversitesi, Tıp Fakültesi , İstanbul, Türkiye
DOI : 10.12991/201115436

Summary

Bu çalışmada sıçanlarda yanık sonucu gelişen ağrı ve inflamasyonda periferik ve santral uygulanan oksitosinin olası anti-nosiseptif ve anksiyolitik etkileri ile hasarlı cilt dokusundaki olası anti-inflamatuvar etkilerinin incelenmesi amaçlandı. Bu amaçla her iki cinsiyette Sprague Dawley sıçanların ensesinde 18 mm çapında 2 yanık oluşturuldu. Yanıktan 4 gün önce başlayıp ve 7 gün sonrasında devam ederek serum fizyolojik (SF) veya OT tedavisi (i.p. 20 mg/ kg/gün; i.s.v. 200 ng/sıçan/gün) verildi. Anksiyete düzeylerini belirlemek için delikli kutuda hareketlilik testi ve ağrı eşiğini ölçmek için kuyruk çekme testi yanık öncesi ve yanık sonrası 1. ve 7. günlerde yapıldı. Yanığın 7. gününde sıçanlar dekapite edilerek mikroskopik inceleme için yanık bölgelerinden cilt örnekleri alındı. Sıçanlarda eksojen verilen oksitosin yara dokusundaki inflamatuvar yanıtı hafifletti ve 1. haftada yanık sonrası artmış bulunan anksiyeteyi azalttı. Sıçanlara uygulanan dairesel lokal yanık, ağrı eşiklerini i.p. OT tedavi alan gruplarda değiştirmedi. OT, i.s.v. kanül yerleştirilmesine bağlı ortaya çıkan hipoaljeziyi engelledi.

Introduction

Annelik davranışlarından sorumlu bir nöropeptit olan oksitosin (OT), hipotalamustaki paraventriküler ve supraoptik çekirdeklerde üretilir[1,2] ve nörofizin denen proteinler aracılığı ile arka hipofize taşınarak buradan kana salınır[3,4,5]. OT reseptörleri, miyometrium, meme bezi, endometriyum, desidua, over, testis, epididim, vas deferens, timus, kalp, böbrek ve beynin çeşitli bölgelerinde bulunur[6]. Yapısı vazopressine benzeyen OT, adrenokortikotrofik hormon (ACTH) salgısını arttırmak yoluyla zayıf bir antidiüretik etki de gösterir[7]. OT kan düzeyi ovulasyon, doğum eylemi, laktasyon ve bazı stres durumlarında artar. OT uterus dokusunda kontraksiyon gücünü ve sıklığını artırırken, meme bezlerinde asinusların çevresindeki miyoepitelyal hücreleri kasarak sütün duktuslara geçmesini sağlar. OT beyindeki etkisi ile sosyal ve seksüel davranışların oluşumunda da önemlidir[2,3]. Doğumda uterus düz kas kontraksiyonunu ve doğum sonrası emzirme esnasında memeden süt çıkışını düzenleyici rolünün[3,6] yanısıra, kardiyovasküler ve natriüretik düzenlemede rol aldığı da gösterilmiştir[8]. OT düşük dozlarda uygulandığında kendine özgü reseptörleri aktive ederek vazodilatasyon sağlarken, yüksek dozlarda anjiyotensin-vazopressin (AVP) reseptörlerinin uyarılmasıyla vazokonstriksiyona bağlı hipertansiyona neden olur[8].

OT'nin dişi ve erkek sıçanlarda antistres etkili olduğu, yara iyileşmesini hızlandırdığı, kilo alımını uyardığı ve endojen opioid etkiyi artırdığı bildirilmiştir[4,9]. OT'nin sistemik uygulandığında gastrointestinal motiliteyi ve düz kas kontraktilitesini değiştirdiği[10,11] ve deneysel mide ve duodenum ülserlerinde antisekretuvar ve antiülser etkili olduğu gösterilmiştir[12]. Diğer taraftan OT'in iskemik deri fleplerinin yaşam süresini uzattığı[13], pençede karrageninle indüklenen hiperaljezide inflamasyonu azalttığı[14] ve OT'nin bu anti-inflamatuvar etkilerinde büyüme faktörlerinin aracılık ettiği gösterilmiştir. Ayrıca, OT'nin sıcak su ile oluşturulan yanıkta sistemik yanıt oluşturarak doku hasarını ve gastrik mukozal oksidatif hasarını hafiflettiği bulundu[15].

Yapılan çalışmalar supraooptik çekirdeğin (SON) uyarılmasının ağrı eşiğini uyardığını ve bu çekirdeğin koterle yakılarak harap edilmesinin ise ağrı eşiğini azalttığını göstermiştir[16]. Başka bir çalışmada da, sıçanlarda hipotalamik paraventriküler çekirdekteki lezyonların spinal korddaki endojen immünoreaktif AVP ve OT düzeylerini azalttığı, fakat nosiseptif eşiği değiştirmediği gözlenmiştir[17]. İlginç olarak, kanda OT konsantrasyonunda büyük bir yükselmeye neden olan fizyolojik uyaranların, doğum ve v ajinal dilatasyon gibi, ağrı eşiğini yükselttiği bilinmektedir[18]. Ancak, sistemik inflamatuvar bir yanıta neden olmayacak bir yanık yarasınının oluşturduğu ağrı algısının eksojen verilen OT ile nasıl etkilendiğine dair bir bulgu bulunmamaktadır.

Sıçanlarda yanık sonucu gelişen ağrı ve inflamasyonda periferik ve santral uygulanan oksitosinin anti-nosiseptif ve anksiyolitik etkileri ile hasarlı cilt dokusundaki olası antiinflamatuvar etkilerini ortaya koymak amacıyla bu çalışma planlanmıştır.

Methods

Çalışmada Marmara Üniversitesi Deney Hayvanları Uygulama ve Araştırma Merkezi'nden temin edilen 250-300 gr ağırlığında her iki cinsiyette Sprague Dawley sıçanlar sıcaklığı 22 ± 2 ºC' de, nemi % 65-70 oranında korunan ve 12 saat aydınlık-12 saat karanlık dönemlerine sahip bir ortamda standart laboratuvar yemiyle beslendiler, su ve yem kısıtlaması yapılmadı. Çalışma için Marmara Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul'undan onay alındı.

Deney Protokolü
Tüm sıçanlar (n=36) yanık öncesi 4 gün önceden başlayan ve sonrasında 7 gün devam eden toplam 11 günlük tedavilerine göre üç gruba ayrıldılar: kontrol yanık grubu (n=12), serum fizyolojik (SF) verilen yanık grubu (n= 12) ve OT tedavisi verilen yanık grubu (n=12). Gruplara SF intraperitoneal (i.p.; 1 ml/kg/gün) veya intraserebroventriküler (i.s.v.; 8 ml /sıçan/ gün) olarak verildi. OT tedavisi de i.p. (20 mg/kg/gün) veya i.s.v. (200 ng/sıçan/gün) olarak uygulandı.

Deneyin 4. günü, yanık uygulamasından 1 saat önce tüm sıçanlara delikli kutuda hareket testi (HT) ve kuyruk çekme (KÇT) testleri yapıldı. Bu testler sonrasında tüm gruplara yanık modeli uygulandı ve yanık sonrası 1. ve 7. günlerde HT ve KÇT testleri tekrarlandı. Yanığın 7. gününde sıçanlar dekapite edilerek mikroskopik inceleme için yanık bölgelerinden cilt örnekleri alındı.

İntraserebroventriküler (i.s.v.) Kanül Yerleştirilmesi
Sıçanlar ketamin (100 mg/kg ip) ve klorpromazin (0,75 mg/ kg) ile anestezi edildi ve stereotaksi cihazına (Stoelting Lab, Wood Dale, Illinois, ABD) yerleştirildi. Paxinos ve Watson atlasına göre paslanmaz çelik kanül i.s.v. kanül sağ lateral serebral ventriküllerine (bregmaya göre 1.1 mm kaudal ve 1.5 mm lateral, kafatası yüzeyine göre 3.2 mm ventral) takıldı[19]. Daha sonra kanülün etrafına üç vida yerleştirip dental akrilik ile kafatasına tespit edildi. Deneylere kanül yerleştirilmesinden bir hafta sonra başlandı. Her deney sonunda, kanülün yerini kontrol amacıyla dekapitasyon öncesi metilen mavisi enjeksiyonu yapıldı.

Deneysel Yanık Modeli
Hafif eter anestezisi altında, sıçanların enseleri traş edildi. Özel hazırlanmış metal plaka (18 mm çap, 2 mm genişlik, 42 cm sap uzunluğu; Gülmode Ltd., İstanbul) alevde kor haline gelene kadar (yaklaşık 75 sn ) bekletilip, 30 sn havada soğutulduktan sonra hayvanların traş edilmiş sırt derisine kısa süreli 2 farklı bölgede cilde temas ettirilerek dairesel lokal hasar oluşturuldu. Yanıktan hemen sonra sıvı replasmanı amacıyla yanık bölgesi dışındaki bir cilt altı bölgesine 1 ml/kg SF enjekte edildi. Bu yanık modeli, hayvanlarda ciddi bir travma oluşturmayıp hayvanın hareketliliğini etkilemeyen bir yöntem olarak geliştirilip daha önce tarafımızdan kullanılmıştır[20].

Delikli Kutuda Hareket Testi (HT)
HT sıçanların endişe düzeylerinin değerlendirilmesi için yapıldı. Bu test, yan kenarları 47 cm yükseklikte, 66x56 cm ölçülerinde ve tabanında 3,8 cm çapında 16 delik bulunan üstü açık tahta kutuda, her bir sıçan 5 dakika kalacak şekilde gerçekleştirildi. Testler video kamera ile kaydedilerek daha sonra 4 gözlemci tarafından izlenerek değerlendirildi. Sıçanların 5 dakika boyunca; delikten bakma sayısı, immobilizasyon süresi ve şahlanma sayısı takip edildi ve parametrelerden 5 dakikalık hareket indeksi belirlendi. Sıçanların hareketliliklerinin ve delikten bakma sayılarının azalması, araştırıcı davranışlarının azalması anlamına gelir ve bu da artmış anksiyete olarak değerlendirilmektedir[21].

Kuyruk Çekme Testi (KÇT)
KÇT sıçanların ağrı eşik değerlerinin belirlenmesi için yapıldı. Sıçanlar KÇT'den en az 5 dakika öncesine kadar kafeslerinde dinlenme halinde tutuldular. Sıçanlar cihaza, ısıtıcı kaynak kuyruklarının distal 1/3'üne gelecek şekilde yerleştirildi. Kuyruk çekme, cihaz tarafından otomatik olarak algılanıp süre saniye cinsinden kaydedildi. Eğer sıçanlar kuyruklarını çekmiyorlarsa sonlandırma süresi (cut-off zamanı) 20 sn olarak kabul edildi.

Işık Mikroskopisi ile İnceleme
Yanık sonrası 7. günde dekapite edilen sıçanların yanık cilt bölgelerinden örnekler alınarak %10'luk formaldehitle fikse edildi ve yükselen alkol serilerinden geçirilerek dehidratasyon, toluenle şeffaflandırma işlemlerinden sonra parafine gömüldü. Yaklaşık 5–6 μm kalınlığındaki kesitlere morfolojik değerlendirme ve kollajen liflerinin incelenmesi için Masson'un üçlü boyası ve mast hücrelerini incelemek içinde %1'lik toluidin mavisi boyası uygulandı. Hasar değerlendirmesinde epidermal dejenerasyon, dermal ödem, kıl folikülleri dejenerasyonu, inflamatuar hücre infiltrasyonu, hemoraji, ve mast hücre göçü ve aktivasyonu kriterlerine bakıldı. Her kesitte en az beş mikroskopik bölge 200x büyütmede Olympus BX51 fotomikroskobunda incelendi.

İstatistiksel Analiz
Verilerin analizi için GraphPad Prizm-4 istatistik programı kullanıldı. Sonuçlar Mann Whitney U testi ve Student'ın t-testi ile incelendi ve ortalamalar arasındaki farkın p<0.05 olması durumunda istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Results

Yanık öncesi 4. günde delikli kutuda hareket testleri değerlendirilen i.s.v. ve i.p. uygulaması yapılan tüm sıçanların anksiyete düzeyleri benzer bulunmuştur (Şekil 1). Yanığın 1. gününde, i.p. tedavi almayan grupta anksiyete artışı olmadığına işaret edecek şekilde HT indekslerinde fark bulunmazken, i.p. OT ve SF tedavisi alan yanık gruplarında anksiyetenin anlamlı (p<0.01; Şekil 1a) olarak arttığını ortaya koyacak şekilde HT indeksinde azalma gözlendi. Yanık sonrası 7. günde ise, tedavi grubuna benzer şekilde tedavisiz grupta da anksiyete artarken, i.p. OT grubundaki anksiyete artışının gerilediği gözlendi.

ŞEKİL 1: a) İntraperitoneal (ip) uygulama b) İntraserebroventriküler (isv) uygulama: Deney gruplarında delikli kutuda hareketlilik indeksi ile ölçülen anskiyete düzeyleri. Azalmış hareket indeksi artmış anksiyete olarak yorumlanmaktadır. Hareketlilik indeksi sıçanların 5 dakika boyunca delikten bakma sayısı, immobilizasyon süresi ve şahlanma sayılarından elde edilmiştir. *p<0.05, **p<0.01, yanık öncesi ölçümüne göre.

Benzer şekilde, anksiyete artışı i.s.v. OT tedavisi verilen grupta hem 1. gün (p<0.05), hem de 7. gün (p<0.01) yanık grubunda gözlenirken, tedavi almayan ve SF tedavisi alan gruplarda anksiyete değişikliklerinin anlamlı düzeye erişmediği gözlenmiştir (Şekil 1b).

Yanık uygulanmış tüm gruplarda kuyruk çekme testi ile ağrı eşiği değerlendirildiğinde, i.s.v. kanül uygulamasının SF verilen gruplarda yanık öncesi ve sonrası tüm gruplarda ağrı eşiğini 3 kat artırdığı gözlenmiştir (p<0.001; Şekil 2). Buna karşın, OT uygulaması ağrı eşiklerini, yanık öncesinde olduğu gibi, 1. ve 7. gün yanık gruplarında da anlamlı olarak azaltmıştır (p<0.01). Diğer taraftan, i.p. uygulanan OT'nin ağrı eşiğinde etkisi gözlenmemiştir.

ŞEKİL 2: İntraperitoneal (ip) ve intraserebroventriküler (isv) uygulanan serum fizyolojik veya oksitosin (OT) ile kuyruk çekme yanıtları. **p<0.05, ***p<0.001, ip tedavili eşdeğer gruba göre; ++p<0.01, +++p<0.001, SF grubuna göre.

Yanık cilt dokusunun histopatolojik olarak değerlendirilmesinde OT'nin yanığın iyileşme sürecinde önemli farklılık yarattığı görülmüştür. Özellikle i.s.v OT tedavisi alan grupta SF grubuna göre kollajen oluşumunun arttığı, sağlam kıl foliküllerinin bulunduğu, az sayıda inflamatuvar hücre infiltrasyonu olduğu gözlenmiştir (Şekil 3).

ŞEKİL 3: Kontrol grubu (A): Düzenli epidermis, kıl folikülleri, kollajen yapısı ve az sayıda mast hücresi. Yanık grubu (B): İleri derecede hasarlı epidermis (ok), kıl folikülleri (ok başı), kollejen yapısı (c), kanama bölgeleri (h), artmış enflamatuvar hücre infiltrasyonu (*) ve özellikle epidermis altına ve kıl foliküllerinin etrafına göç etmiş ve aktive olmuş mast hücreleri (ok). Yanık+OT (isv) grubu (C): Düzelmeye başlamış epidermis (ok), kıl folikülleri (ok başı), az sayıda enflamatuvar hücre infiltrasyonu (*), göç etmiş ve aktive olmuş mast hücreleri (ok). Yanık+OT (ip) grubu (D): Orta düzeyde hasarlı epidermis (ok), kıl folikülleri (ok başı), İnflamatuvar hücre infiltrasyonu (*), göç etmiş ve aktive olmuş mast hücreleri (ok); Sol taraftaki resimler: Masson’un üçlü boyası, X200, küçük resimler: X400; Sağ taraftaki resimler: Toluidin mavisi boyası, X400.

Reference

1) Neumann I, Douglas AJ, Pittman QJ, Russell JA, Landgraf R. Oxytocin released within the supraoptic nucleus of the rat brain by positive feedback action is involved in parturition-releated events. J Neuroendocrinol 1996; 8(3): 227-233.

2) Petersson M, Wieberg U, Lundeberg T, Moberg KU. Oxytocin decreases carrageenan induced inflammation in rats. Peptides 2001; 22; 1479-1484.

3) Cabanac M. Emotion and phylogeny. Jpn J Physiol 1999; 49(1); 1-10.

4) Kovacs G.L, Sarnyai Z, Szabo G. Oxytocin and addiction: a review. Psychoneuroendocrinology 1998; 23(8); 945- 962.

5) Merighi A. Costorage and coexistence of neuropeptides in the mammalian CNS. Progress Neurobiol 2002; 66: 161-190.

6) Kimura T, Saji F, Nishimori K, Ogita K, Nakamura H, Koyama M, Murata Y. Molecular regulation of the oxytocin receptor in peripheral organs. J Mol Endocrinol 2003; 30(2): 109-105.

7) Li C, Wang W, Summer SN, Westfall TD, Brooks DP, Falk S, Schrier RW. Molecular mechanisms of antidiuretic effect of oxytocin. J Am Soc Nephrol 2008;19(2):225-223.

8) Petersson M, Lundeberg T, Uvnas-Moberg K. Short-term increase and long-term decrease of blood pressure in response to oxytocin-potentiating effect of female steroid hormones. J Cardiovasc Pharmacol 1999; 33; 102-108.

9) Uvnas-Moberg K. Oxytocin may mediate the benefits of positive social interaction and emotions. Psychoneuroendocrinology 1998; 23(8); 819-835.

10) Ohlsson B, Sjo¨lund K. Oxytocin increased stool frequency in patients with chronic constipation, A preliminary report. Int J Surg Investig 2001;3: 287–292.

11) Duridanova DB, Nedelcheva MD, Gagov HS. Oxytocininduced changes in single cell K+ currents and smooth muscle contraction of guinea-pig gastric antrum. Eur J Endocrinol 1997;136:531–538.

12) Monstein HJ, Grahn N, Truedsson M, Ohlsson B. Oxytocin and oxytocin-receptor mRNA expression in the human gastrointestinal tract: a polymerase chain reaction study. Regul Pept 2004;119:39–44.

13) Petersson M, Lundeberg T, Sohlström A, Wiberg U, Uvnäs-Moberg K. Oxytocin increases the survival of musculocutaneous flaps. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacol 1998;357:701–704.

14) Petersson M, Wiberg U, Lundeberg T, Uvna¨s-Moberg K. Oxytocin decreases carrageenan induced inflammation in rats, Peptides 2001;22(9):1479–1484.

15) Işeri SO, Gedik IE, Erzik C, Uslu B, Arbak S, Gedik N, Yeğen BC. Oxytocin ameliorates skin damage and oxidant gastric injury in rats with thermal trauma. Burns 2008;34(3):361-369.

16) Yang J, Yang Y, Chen JM, Liu WY, Wang CH, Lin BC. Effect of hypothalamic supraoptic nucleus on acupuncture analgesia in the rat. Brain Res Bull 2008;75:681–686.

17) Millan MJ, Schmauss C, Millan MH, Herz A. Vasopressin and oxytocin in the rat spinal cord: analysis of their role in the control of nociception. Brain Res 1984;309:384–388.

18) Richard P, Moos F, Freund-Mercier MJ. Central effects of oxytocin. Physiol Rev 1991;71: 331–370.

19) Paxinos, G, Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, New York: Academic, 1996.

20) Jahovic N, Güzel E, Arbak S, Yeğen BC. The healingpromoting effect of saliva on skin burn is mediated by epidermal growth factor (EGF): role of the neutrophils. Burns 2004;30(6):531-538.

21) Çakır B, Kasımay O, Kolgazi M, Ersoy Y, Ercan F, Yeğen BC. Stress-induced multiple organ damage in rats is ameliorated by the antioxidant and anxiolytic effects of regular exercise. Cell Biochem Funct 2010;28(6):469-479.

22) Madrazo I, Franco-Bourland RE, Leon-Meza VM, Mena I. Intraventricular somatostatin-14, arginine vasopressin, and oxytocin: analgesic effect in a patient with intractable cancer pain. Appl Neurophysiol 1987; 50: 427-431.

23) Yang J, Yang Y, Chen JM, Liu WY, Wang CH, Lin BC. Central oxytocin enhances antinociception in the rat. Peptides 2007;28(5):1113-1119.

24) Uvnäs-Moberg K, Alster P, Petersson M, Sohlström A, Björkstrand E. Postnatal oxytocin injections cause sustained weight gain and increased nociceptive thresholds in male and female rats. Pediatr Res 1998;43(3):344-348.

25) Yu SQ, Lundeberg T, Yu LC. Involvement of oxytocin in spinal antinociception in rats with inflammation. Brain Res 2003;983(1-2):13-22.

26) Işeri SO, Düşünceli F, Erzik C, Uslu B, Arbak S, Yeğen BC. Oxytocin or social housing alleviates local burn injury in rats. J Surg Res 2010;162(1):122-131.

27) Yeğen BÇ. Oxytocin and hypothalamo-pituitaryadrenal axis. Marmara Pharm J 2010; 14: 61-66.

Marmara University