2Marmara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji ABD, İstanbul, Türkiye
3Marmara Üniversitesi, Tıp Fakültesi , İstanbul, Türkiye DOI : 10.12991/201115436
Summary
Bu çalışmada sıçanlarda yanık sonucu gelişen ağrı ve inflamasyonda periferik ve santral uygulanan oksitosinin olası anti-nosiseptif ve anksiyolitik etkileri ile hasarlı cilt dokusundaki olası anti-inflamatuvar etkilerinin incelenmesi amaçlandı. Bu amaçla her iki cinsiyette Sprague Dawley sıçanların ensesinde 18 mm çapında 2 yanık oluşturuldu. Yanıktan 4 gün önce başlayıp ve 7 gün sonrasında devam ederek serum fizyolojik (SF) veya OT tedavisi (i.p. 20 mg/ kg/gün; i.s.v. 200 ng/sıçan/gün) verildi. Anksiyete düzeylerini belirlemek için delikli kutuda hareketlilik testi ve ağrı eşiğini ölçmek için kuyruk çekme testi yanık öncesi ve yanık sonrası 1. ve 7. günlerde yapıldı. Yanığın 7. gününde sıçanlar dekapite edilerek mikroskopik inceleme için yanık bölgelerinden cilt örnekleri alındı. Sıçanlarda eksojen verilen oksitosin yara dokusundaki inflamatuvar yanıtı hafifletti ve 1. haftada yanık sonrası artmış bulunan anksiyeteyi azalttı. Sıçanlara uygulanan dairesel lokal yanık, ağrı eşiklerini i.p. OT tedavi alan gruplarda değiştirmedi. OT, i.s.v. kanül yerleştirilmesine bağlı ortaya çıkan hipoaljeziyi engelledi.Introduction
Annelik davranışlarından sorumlu bir nöropeptit olan oksitosin (OT), hipotalamustaki paraventriküler ve supraoptik çekirdeklerde üretilir[1,2] ve nörofizin denen proteinler aracılığı ile arka hipofize taşınarak buradan kana salınır[3,4,5]. OT reseptörleri, miyometrium, meme bezi, endometriyum, desidua, over, testis, epididim, vas deferens, timus, kalp, böbrek ve beynin çeşitli bölgelerinde bulunur[6]. Yapısı vazopressine benzeyen OT, adrenokortikotrofik hormon (ACTH) salgısını arttırmak yoluyla zayıf bir antidiüretik etki de gösterir[7]. OT kan düzeyi ovulasyon, doğum eylemi, laktasyon ve bazı stres durumlarında artar. OT uterus dokusunda kontraksiyon gücünü ve sıklığını artırırken, meme bezlerinde asinusların çevresindeki miyoepitelyal hücreleri kasarak sütün duktuslara geçmesini sağlar. OT beyindeki etkisi ile sosyal ve seksüel davranışların oluşumunda da önemlidir[2,3]. Doğumda uterus düz kas kontraksiyonunu ve doğum sonrası emzirme esnasında memeden süt çıkışını düzenleyici rolünün[3,6] yanısıra, kardiyovasküler ve natriüretik düzenlemede rol aldığı da gösterilmiştir[8]. OT düşük dozlarda uygulandığında kendine özgü reseptörleri aktive ederek vazodilatasyon sağlarken, yüksek dozlarda anjiyotensin-vazopressin (AVP) reseptörlerinin uyarılmasıyla vazokonstriksiyona bağlı hipertansiyona neden olur[8].OT'nin dişi ve erkek sıçanlarda antistres etkili olduğu, yara iyileşmesini hızlandırdığı, kilo alımını uyardığı ve endojen opioid etkiyi artırdığı bildirilmiştir[4,9]. OT'nin sistemik uygulandığında gastrointestinal motiliteyi ve düz kas kontraktilitesini değiştirdiği[10,11] ve deneysel mide ve duodenum ülserlerinde antisekretuvar ve antiülser etkili olduğu gösterilmiştir[12]. Diğer taraftan OT'in iskemik deri fleplerinin yaşam süresini uzattığı[13], pençede karrageninle indüklenen hiperaljezide inflamasyonu azalttığı[14] ve OT'nin bu anti-inflamatuvar etkilerinde büyüme faktörlerinin aracılık ettiği gösterilmiştir. Ayrıca, OT'nin sıcak su ile oluşturulan yanıkta sistemik yanıt oluşturarak doku hasarını ve gastrik mukozal oksidatif hasarını hafiflettiği bulundu[15].
Yapılan çalışmalar supraooptik çekirdeğin (SON) uyarılmasının ağrı eşiğini uyardığını ve bu çekirdeğin koterle yakılarak harap edilmesinin ise ağrı eşiğini azalttığını göstermiştir[16]. Başka bir çalışmada da, sıçanlarda hipotalamik paraventriküler çekirdekteki lezyonların spinal korddaki endojen immünoreaktif AVP ve OT düzeylerini azalttığı, fakat nosiseptif eşiği değiştirmediği gözlenmiştir[17]. İlginç olarak, kanda OT konsantrasyonunda büyük bir yükselmeye neden olan fizyolojik uyaranların, doğum ve v ajinal dilatasyon gibi, ağrı eşiğini yükselttiği bilinmektedir[18]. Ancak, sistemik inflamatuvar bir yanıta neden olmayacak bir yanık yarasınının oluşturduğu ağrı algısının eksojen verilen OT ile nasıl etkilendiğine dair bir bulgu bulunmamaktadır.
Sıçanlarda yanık sonucu gelişen ağrı ve inflamasyonda periferik ve santral uygulanan oksitosinin anti-nosiseptif ve anksiyolitik etkileri ile hasarlı cilt dokusundaki olası antiinflamatuvar etkilerini ortaya koymak amacıyla bu çalışma planlanmıştır.
Methods
Çalışmada Marmara Üniversitesi Deney Hayvanları Uygulama ve Araştırma Merkezi'nden temin edilen 250-300 gr ağırlığında her iki cinsiyette Sprague Dawley sıçanlar sıcaklığı 22 ± 2 ºC' de, nemi % 65-70 oranında korunan ve 12 saat aydınlık-12 saat karanlık dönemlerine sahip bir ortamda standart laboratuvar yemiyle beslendiler, su ve yem kısıtlaması yapılmadı. Çalışma için Marmara Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul'undan onay alındı.
Deney Protokolü
Tüm sıçanlar (n=36) yanık öncesi 4 gün önceden başlayan ve
sonrasında 7 gün devam eden toplam 11 günlük tedavilerine
göre üç gruba ayrıldılar: kontrol yanık grubu (n=12), serum
fizyolojik (SF) verilen yanık grubu (n= 12) ve OT tedavisi verilen
yanık grubu (n=12). Gruplara SF intraperitoneal (i.p.; 1
ml/kg/gün) veya intraserebroventriküler (i.s.v.; 8 ml /sıçan/
gün) olarak verildi. OT tedavisi de i.p. (20 mg/kg/gün) veya
i.s.v. (200 ng/sıçan/gün) olarak uygulandı.
Deneyin 4. günü, yanık uygulamasından 1 saat önce tüm sıçanlara delikli kutuda hareket testi (HT) ve kuyruk çekme (KÇT) testleri yapıldı. Bu testler sonrasında tüm gruplara yanık modeli uygulandı ve yanık sonrası 1. ve 7. günlerde HT ve KÇT testleri tekrarlandı. Yanığın 7. gününde sıçanlar dekapite edilerek mikroskopik inceleme için yanık bölgelerinden cilt örnekleri alındı.
İntraserebroventriküler (i.s.v.) Kanül Yerleştirilmesi
Sıçanlar ketamin (100 mg/kg ip) ve klorpromazin (0,75 mg/
kg) ile anestezi edildi ve stereotaksi cihazına (Stoelting Lab,
Wood Dale, Illinois, ABD) yerleştirildi. Paxinos ve Watson atlasına
göre paslanmaz çelik kanül i.s.v. kanül sağ lateral serebral
ventriküllerine (bregmaya göre 1.1 mm kaudal ve 1.5 mm
lateral, kafatası yüzeyine göre 3.2 mm ventral) takıldı[19].
Daha sonra kanülün etrafına üç vida yerleştirip dental akrilik
ile kafatasına tespit edildi. Deneylere kanül yerleştirilmesinden
bir hafta sonra başlandı. Her deney sonunda, kanülün yerini
kontrol amacıyla dekapitasyon öncesi metilen mavisi enjeksiyonu
yapıldı.
Deneysel Yanık Modeli
Hafif eter anestezisi altında, sıçanların enseleri traş edildi.
Özel hazırlanmış metal plaka (18 mm çap, 2 mm genişlik, 42
cm sap uzunluğu; Gülmode Ltd., İstanbul) alevde kor haline
gelene kadar (yaklaşık 75 sn ) bekletilip, 30 sn havada soğutulduktan
sonra hayvanların traş edilmiş sırt derisine kısa süreli
2 farklı bölgede cilde temas ettirilerek dairesel lokal hasar
oluşturuldu. Yanıktan hemen sonra sıvı replasmanı amacıyla yanık bölgesi dışındaki bir cilt altı bölgesine 1 ml/kg SF enjekte
edildi. Bu yanık modeli, hayvanlarda ciddi bir travma oluşturmayıp
hayvanın hareketliliğini etkilemeyen bir yöntem
olarak geliştirilip daha önce tarafımızdan kullanılmıştır[20].
Delikli Kutuda Hareket Testi (HT)
HT sıçanların endişe düzeylerinin değerlendirilmesi için yapıldı.
Bu test, yan kenarları 47 cm yükseklikte, 66x56 cm ölçülerinde
ve tabanında 3,8 cm çapında 16 delik bulunan üstü açık
tahta kutuda, her bir sıçan 5 dakika kalacak şekilde gerçekleştirildi.
Testler video kamera ile kaydedilerek daha sonra 4 gözlemci
tarafından izlenerek değerlendirildi. Sıçanların 5 dakika
boyunca; delikten bakma sayısı, immobilizasyon süresi ve
şahlanma sayısı takip edildi ve parametrelerden 5 dakikalık
hareket indeksi belirlendi. Sıçanların hareketliliklerinin ve delikten
bakma sayılarının azalması, araştırıcı davranışlarının
azalması anlamına gelir ve bu da artmış anksiyete olarak değerlendirilmektedir[21].
Kuyruk Çekme Testi (KÇT)
KÇT sıçanların ağrı eşik değerlerinin belirlenmesi için yapıldı.
Sıçanlar KÇT'den en az 5 dakika öncesine kadar kafeslerinde
dinlenme halinde tutuldular. Sıçanlar cihaza, ısıtıcı kaynak
kuyruklarının distal 1/3'üne gelecek şekilde yerleştirildi. Kuyruk
çekme, cihaz tarafından otomatik olarak algılanıp süre saniye
cinsinden kaydedildi. Eğer sıçanlar kuyruklarını çekmiyorlarsa
sonlandırma süresi (cut-off zamanı) 20 sn olarak kabul
edildi.
Işık Mikroskopisi ile İnceleme
Yanık sonrası 7. günde dekapite edilen sıçanların yanık cilt
bölgelerinden örnekler alınarak %10'luk formaldehitle fikse
edildi ve yükselen alkol serilerinden geçirilerek dehidratasyon,
toluenle şeffaflandırma işlemlerinden sonra parafine gömüldü.
Yaklaşık 5–6 μm kalınlığındaki kesitlere morfolojik
değerlendirme ve kollajen liflerinin incelenmesi için
Masson'un üçlü boyası ve mast hücrelerini incelemek içinde
%1'lik toluidin mavisi boyası uygulandı. Hasar değerlendirmesinde
epidermal dejenerasyon, dermal ödem, kıl folikülleri
dejenerasyonu, inflamatuar hücre infiltrasyonu, hemoraji, ve
mast hücre göçü ve aktivasyonu kriterlerine bakıldı. Her kesitte
en az beş mikroskopik bölge 200x büyütmede Olympus
BX51 fotomikroskobunda incelendi.
İstatistiksel Analiz
Verilerin analizi için GraphPad Prizm-4 istatistik programı
kullanıldı. Sonuçlar Mann Whitney U testi ve Student'ın t-testi
ile incelendi ve ortalamalar arasındaki farkın p<0.05 olması
durumunda istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Results
Yanık öncesi 4. günde delikli kutuda hareket testleri değerlendirilen i.s.v. ve i.p. uygulaması yapılan tüm sıçanların anksiyete düzeyleri benzer bulunmuştur (Şekil 1). Yanığın 1. gününde, i.p. tedavi almayan grupta anksiyete artışı olmadığına işaret edecek şekilde HT indekslerinde fark bulunmazken, i.p. OT ve SF tedavisi alan yanık gruplarında anksiyetenin anlamlı (p<0.01; Şekil 1a) olarak arttığını ortaya koyacak şekilde HT indeksinde azalma gözlendi. Yanık sonrası 7. günde ise, tedavi grubuna benzer şekilde tedavisiz grupta da anksiyete artarken, i.p. OT grubundaki anksiyete artışının gerilediği gözlendi.Benzer şekilde, anksiyete artışı i.s.v. OT tedavisi verilen grupta hem 1. gün (p<0.05), hem de 7. gün (p<0.01) yanık grubunda gözlenirken, tedavi almayan ve SF tedavisi alan gruplarda anksiyete değişikliklerinin anlamlı düzeye erişmediği gözlenmiştir (Şekil 1b).
Yanık uygulanmış tüm gruplarda kuyruk çekme testi ile ağrı eşiği değerlendirildiğinde, i.s.v. kanül uygulamasının SF verilen gruplarda yanık öncesi ve sonrası tüm gruplarda ağrı eşiğini 3 kat artırdığı gözlenmiştir (p<0.001; Şekil 2). Buna karşın, OT uygulaması ağrı eşiklerini, yanık öncesinde olduğu gibi, 1. ve 7. gün yanık gruplarında da anlamlı olarak azaltmıştır (p<0.01). Diğer taraftan, i.p. uygulanan OT'nin ağrı eşiğinde etkisi gözlenmemiştir.
Yanık cilt dokusunun histopatolojik olarak değerlendirilmesinde OT'nin yanığın iyileşme sürecinde önemli farklılık yarattığı görülmüştür. Özellikle i.s.v OT tedavisi alan grupta SF grubuna göre kollajen oluşumunun arttığı, sağlam kıl foliküllerinin bulunduğu, az sayıda inflamatuvar hücre infiltrasyonu olduğu gözlenmiştir (Şekil 3).
Reference
1) Neumann I, Douglas AJ, Pittman QJ, Russell JA, Landgraf
R. Oxytocin released within the supraoptic nucleus
of the rat brain by positive feedback action is involved in
parturition-releated events. J Neuroendocrinol 1996; 8(3):
227-233.
2) Petersson M, Wieberg U, Lundeberg T, Moberg KU.
Oxytocin decreases carrageenan induced inflammation
in rats. Peptides 2001; 22; 1479-1484.
3) Cabanac M. Emotion and phylogeny. Jpn J Physiol 1999;
49(1); 1-10.
4) Kovacs G.L, Sarnyai Z, Szabo G. Oxytocin and addiction:
a review. Psychoneuroendocrinology 1998; 23(8); 945-
962.
5) Merighi A. Costorage and coexistence of neuropeptides
in the mammalian CNS. Progress Neurobiol 2002; 66:
161-190.
6) Kimura T, Saji F, Nishimori K, Ogita K, Nakamura H,
Koyama M, Murata Y. Molecular regulation of the oxytocin
receptor in peripheral organs. J Mol Endocrinol 2003;
30(2): 109-105.
7) Li C, Wang W, Summer SN, Westfall TD, Brooks DP,
Falk S, Schrier RW. Molecular mechanisms of antidiuretic
effect of oxytocin. J Am Soc Nephrol 2008;19(2):225-223.
8) Petersson M, Lundeberg T, Uvnas-Moberg K. Short-term
increase and long-term decrease of blood pressure in response
to oxytocin-potentiating effect of female steroid
hormones. J Cardiovasc Pharmacol 1999; 33; 102-108.
9) Uvnas-Moberg K. Oxytocin may mediate the benefits of
positive social interaction and emotions. Psychoneuroendocrinology
1998; 23(8); 819-835.
10) Ohlsson B, Sjo¨lund K. Oxytocin increased stool frequency
in patients with chronic constipation, A preliminary
report. Int J Surg Investig 2001;3: 287–292.
11) Duridanova DB, Nedelcheva MD, Gagov HS. Oxytocininduced
changes in single cell K+ currents and smooth
muscle contraction of guinea-pig gastric antrum. Eur J
Endocrinol 1997;136:531–538.
12) Monstein HJ, Grahn N, Truedsson M, Ohlsson B. Oxytocin
and oxytocin-receptor mRNA expression in the human
gastrointestinal tract: a polymerase chain reaction
study. Regul Pept 2004;119:39–44.
13) Petersson M, Lundeberg T, Sohlström A, Wiberg U,
Uvnäs-Moberg K. Oxytocin increases the survival of
musculocutaneous flaps. Naunyn-Schmiedebergs Arch
Pharmacol 1998;357:701–704.
14) Petersson M, Wiberg U, Lundeberg T, Uvna¨s-Moberg K.
Oxytocin decreases carrageenan induced inflammation
in rats, Peptides 2001;22(9):1479–1484.
15) Işeri SO, Gedik IE, Erzik C, Uslu B, Arbak S, Gedik N,
Yeğen BC. Oxytocin ameliorates skin damage and oxidant
gastric injury in rats with thermal trauma. Burns
2008;34(3):361-369.
16) Yang J, Yang Y, Chen JM, Liu WY, Wang CH, Lin BC. Effect
of hypothalamic supraoptic nucleus on acupuncture
analgesia in the rat. Brain Res Bull 2008;75:681–686.
17) Millan MJ, Schmauss C, Millan MH, Herz A. Vasopressin
and oxytocin in the rat spinal cord: analysis of their role
in the control of nociception. Brain Res 1984;309:384–388.
18) Richard P, Moos F, Freund-Mercier MJ. Central effects of
oxytocin. Physiol Rev 1991;71: 331–370.
19) Paxinos, G, Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates,
New York: Academic, 1996.
20) Jahovic N, Güzel E, Arbak S, Yeğen BC. The healingpromoting
effect of saliva on skin burn is mediated by
epidermal growth factor (EGF): role of the neutrophils.
Burns 2004;30(6):531-538.
21) Çakır B, Kasımay O, Kolgazi M, Ersoy Y, Ercan F, Yeğen
BC. Stress-induced multiple organ damage in rats is
ameliorated by the antioxidant and anxiolytic effects of
regular exercise. Cell Biochem Funct 2010;28(6):469-479.
22) Madrazo I, Franco-Bourland RE, Leon-Meza VM, Mena
I. Intraventricular somatostatin-14, arginine vasopressin,
and oxytocin: analgesic effect in a patient with intractable
cancer pain. Appl Neurophysiol 1987; 50: 427-431.
23) Yang J, Yang Y, Chen JM, Liu WY, Wang CH, Lin BC.
Central oxytocin enhances antinociception in the rat.
Peptides 2007;28(5):1113-1119.
24) Uvnäs-Moberg K, Alster P, Petersson M, Sohlström A,
Björkstrand E. Postnatal oxytocin injections cause sustained
weight gain and increased nociceptive thresholds in
male and female rats. Pediatr Res 1998;43(3):344-348.
25) Yu SQ, Lundeberg T, Yu LC. Involvement of oxytocin in
spinal antinociception in rats with inflammation. Brain
Res 2003;983(1-2):13-22.
26) Işeri SO, Düşünceli F, Erzik C, Uslu B, Arbak S, Yeğen
BC. Oxytocin or social housing alleviates local burn injury
in rats. J Surg Res 2010;162(1):122-131.
27) Yeğen BÇ. Oxytocin and hypothalamo-pituitaryadrenal
axis. Marmara Pharm J 2010; 14: 61-66.