Editor-in-Chief Hatice Kübra Elçioğlu Vice Editors Levent Kabasakal Esra Tatar Online ISSN 2630-6344 Publisher Marmara University Frequency Bimonthly (Six issues / year) Abbreviation J.Res.Pharm. Former Name Marmara Pharmaceutical Journal
Journal of Research in Pharmacy 2011 , Vol 15 , Num 3
Bioequivalence Studies in Healthy Volunteers: Olmesartan Medoxomil
Latif Özbay1,2, Z. İrem Diler1, Durişehvar Özer Ünal1,2, Dilek Erol1,2
1Yeditepe Üniversitesi , İKU Kliniği/İLU Laboratuvarı, İstanbul, Türkiye
2Yeditepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, İstanbul, Türkiye
DOI : 10.12991/201115428

Summary

Bu çalışmanın amacı 40 mg olmesartan medoksomil (CAS 144689-63-4) içeren test ve referans tablet formülasyonlarının, 36 sağlıklı gönüllüde biyoeşdeğerliğini araştırmaktır. Olmesartan medoksomil hipertansiyon tedavisinde kullanılan bir anjiyotensin II reseptör blokorüdür. Çalışma sırasında, gönüllülere 40 mg olmesartan medoksomil içeren iki ayrı formülasyon (test ve referans) 14 günlük arınma periyodu olan, açık etiketli, randomize, tek-doz, iki periyotlu, çapraz geçişli biyoeşdeğerlik çalışma tasarımı uygulanmıştır. Kan örnekleri uygulama sonrası 72. saate kadar alınmış, olmesartan medoksomilin plasma konsantrasyonları LC-MS/MS (liquid chromatography-tandem mass spectrometry) ile saptanmıştır. Eğri altındaki alan (EAA), ilacın en yüksek kan konsantrasyonu (Cmax), maksimum kan konsantrasyonlarına erişilen zaman (Tmax) bulunarak iki formülasyon karşılaştırılmıştır. %90 güvenlik aralığında, parametrik değerler Cmax için 90.17-102.85, EAA0-last için 90.73-102.34 ve EAA0-∞ için 91.13-102.47 arasında bulunmuştur. Bu değerler protokolde belirtilen kabul sınırların içindedir (80-125%). Sonuç olarak her iki formulasyonun farmakokinetik parametreleri arasında bir fark bulunamamış ve parametreler biyoeşdeğerlik kabul sınırları içinde bulunmuştur.

Introduction

Biyoeşdeğerlik (BE), farmasötik eşdeğer olan iki müstahzarın, aynı dozda verilmesinin ardından biyoyararlanımlarının ve buna bağlı olarak, hem etkililik, hem güvenlilik bakımından esas olarak aynı olmasını sağlayacak derecede benzer olmasıdır.[1,2] BE'de, test ilaç (biyoeşdeğerliği araştırılan ilaç) ve referans ilaç (orijinal ilaç) için karşılaştırılan farmakokinetikparametreler; etken maddenin kandaki en yüksek derişimi (Cmax), eğri altı alan (EAA), Cmax ‘a ulaşılabilmesi için geçen süre (Tmax), terapötik eşdeğerliği de öngörmekte ve farmasötik kalite için in vivo kanıt özelliği taşımaktadır.[3]

BE çalışmalarında, ilacın plazmadaki konsantrasyon- zaman eğrisi, ilacın emilim ve eliminasyon oranını değerlendirmek için kullanılır. Bu çalışmalarda değerlendirme, genellikle etken madde derişiminin ölçülmesi üzerinden yapılmaktadır. Bunun nedeni Cmax ve EAA değerlerinin, formülasyonlar arasındaki farkın değerlendirilmesinde metabolitlerden daha duyarlı olmasıdır. Ancak bazı durumlarda, etken madde ve metabolitleri veya yanlızca metabolitler ile eşdeğerlik değerlendirilmektedir. Eğer ortalamaların popülasyon oranının %90 güven aralığı, EAA ve Cmax için %80-125 sınırları arasında ise, ürünler biyoeşdeğer kabul edilir.[1,2]

Olmesartan, kimyasal adı “(5-metil-2-okso-2H- 1,3-dioksol-4-il)metil 4-(2-hidroksipropan-2-il)- 2-propil-1-({4-[2-(2H-1,2,3,4-tetrazol-5-il)fenil] fenil}metil)-1H-imidazol-5-karboksilat” olup, kapalı formülü C29H30N6O6 ve molekül ağırlığı 558.585 g/mol'dür.[3,4] Molekülün kimyasal yapısı Şekil 1'de verilmiştir. Olmesartan medoksomil, seçici bir anjiyotensin II reseptör (AT1) antagonistidir. Hipertansiyon olgularında arteriyel kan basıncında doza bağlı azalmaya neden olur. Olmesartan medoksomil bir ön ilaçtır. Aktif metaboliti olan olmesartana dönüşmektedir.[3,4] Oral alımından sonra hızla absorbe olur. Olmesartana hidrolize olarak etki gösterir. Oral biyoyararlanımı % 25.6 dır. Absorbsiyon yiyeceklerden etkilenmez. Plazmadaki en yüksek konsantrasyonlarına 1.0-2.0 saat (Tmax) sonra ulaşır. Yüksek oranda plazma proteinlerine bağlanır (% 99). Eliminasyonu hızlıdır. Eliminasyon yarı ömrü (T1/2) 13 saat kadardır. Olmesartan % 35-50 oranında renal yoldan, % 50-60 oranında safra yoluyla feçesten atılır.[3,4]


Click Here to Zoom
Sekil 1: Olmesartan'ın molekül yapısı.

Olmesartan ile yapılan biyoeşdeğerlik çalışmasında, gönüllülere sadece bir doz 40 mg olmesartan medoksomil içeren tablet verildiğinden, gönüllü için bu uygulama sonucunda herhangi bir tedavi edici etki (yarar) ya da risk öngörülmemektedir. Çalışma kapsamında olmesartanın plazma konsantrasyonu ölçülmüş ve biyoeşdeğerlik Cmax, EAA0-last (ilacın ilk uygulanmasından başlayıp son örnekleme zamanına kadar elde edilen plazma konsantrasyonu-zaman eğrisinin altında kalan alan), EAA0-¥ (sonsuza ekstrapole edilen plazma konsantrasyonuzaman eğrisinin altında kalan alan) parametrelerine göre değerlendirilmiştir. Sonuçlar, test ve referans ilacın ortalama oranlarından hesaplanan % 90 güven aralığı (CI) ve birey-içi varyasyon katsayısı (CV) olarak sunulmuştur.

Methods

Çalışma, sağlıklı katılımcılarda, tek-doz, açık etiketli, iki periyodlu, randomize, çapraz geçişli olarak Yeditepe Üniversitesi İyi Klinik Uygulamaları (İKU) Kliniği ve İyi laboratuvar Uygulamaları (İLU) laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. Çalışma Helsinki Deklarasyonu'na, ICH (International Conference on Harmonisation)-İKU Kılavuzu'na, EMA (European Medicines Agency) İKU Kılavuzu ve EMA Biyoeşdeğerlik Kılavuzu'na ve T.C. Sağlık Bakanlığı İKU Kılavuzu ve Biyoeşdeğerlik/Biyoyararlanım Yönetmeliği'ne uygun olarak yürütülmüştür. Çalışma protokolü ve çalışmada gerekli tüm dökümanlar T.C. Sağlık Bakanlığı Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Çalışmaya katılmak isteyen bütün gönüllüler önceden çalışma ile ilgili detaylı olarak bilgilendirilmişler ve katılmayı kabul eden gönüllüler, etik kurul tarafından onaylanan yazılı bilgilendirilmiş gönüllü olur formunu (BGOF) imzalamışlayarak çalışmaya dahil edilmişlerdir.

BE çalışmalarına katılacak gönüllülerin sağlıklı bireyler olmaları gerekmektedir. Kanser ilaçları ve HIV için geliştirilen antiretroviral ilaçlar gibi sitotoksik ilaçlarla yapılan BE çalışmalarına, ilgili hastalıklara sahip gönüllüler kabul edilmektedir. Bu nedenle sağlıklı gönüllülerin belirlenmesi ve seçilmesi için çalışmaya dahil olma ve dahil olmama kriterleri belirlenmiştir. Çalışmaya katılacak olan gönüllüler belirtilen çalışmaya dahil olma kriterleri: yapılan klinik muayene ve tetkikler sonucu sağlıklı olmak, 18-55 yaş arasında erkek olmak, beden kütle indeksi 17.1 - 29 kg/m2 olmak, araştırmacı ile iletişim kurabilme yeteneğine sahip olmak, bilgilendirilmiş gönüllü olur formunu imzalamış olmak ve çalışmaya dahil olmama kriterleri: geçmişte ya da halen mevcut kardiyovasküler, pulmoner, hepatik, renal, hematolojik, gastrointestinal, endokrin, immünolojik, dermatolojik, nörolojik ve psikiyatrik hastalığının olması, klinik olarak anlamlı herhangi bir laboratuvar testinde ya da EKG bulgularında normal sınırların dışında sonuçlar saptanması, HIV, HbsAg ve HCV testlerinin sonuçlarının pozitif olması, günde beş adetten fazla sigara içilmesi, ilaç bağımlılığı, çalışma öncesi yapılan idrar tarama testlerinde bağımlılık yapan ilaçlardan herhangi birinin pozitif olarak saptanması, alkolün kötü kullanımı, (örneğin: günde 2 ünite veya haftada 10 ünite alkolden daha fazla düzenli alkol kullanmak veya alkolizm öyküsü (1 ünite alkol = ½ litre bira, 200 ml şarap veya 50 ml alkollü içki) veya iyileşmiş alkolikler, metilksantin içeren içecek veya yiyeceklerin (kahve, çay, kola, kafein içeren sodalar, çikolata) günde 500 mg metilksantine eşdeğer ölçüde düzenli kullanımı, ilaç ya da yiyecek allerjisi, çalışmadan önceki üç haftalık sürede rutin vitaminler ya da lokal tedaviler dışında herhangi bir ilaç kullanımı, çalışmadan önceki bir aylık sürede ve çalışma sırasında herhangi bir nedenle özel diyet uygulaması, çalışmadan önceki üç ay içinde 500 ml'den fazla kan bağışında bulunulması, çalışmadan önceki üç ay içinde herhangi bir klinik ilaç araştırmasına katılmış olunması, çalışmadan önceki 48 saat içinde ve çalışma süresince aşırı fiziksel egzersiz yapılmış olması, geçmişinde yutma güçlüğü hikayesi olması, iletişim ve anlama sorunlarının olmasıdır. 36 sağlıklı gönüllü çalışmaya katılmadan önce bir şahit eşliğinde, çalışmanın içeriği hakkında bilgilendirme yapıldıktan sonra BGOF imzalanmış ve bu kriterlere göre değerlendirilerek çalışmaya dahil edilmişlerdir.

Çalışma tasarımı
Çalışma başlangıcında, istatistik analizlerden sorumlu uzman tarafından, randomizasyon tablosu ve randomizasyon kodları oluşturulmuştur. Katılımcılar ilaç uygulama gruplarına bu tablo yardımıyla randomize edilerek atanmışlardır. Bu şekilde çalışma başlangıcında dengelenmiş ilaç uygulama grupları oluşturulmuştur. BE çalışmaları iki aşamalıdır. Birinci aşamada, standardize edilmiş koşullarda sağlıklı gönüllülere test ve referans ilaç verilir. İkinci aşamada, ilaç için uygun arınma (washout) sürecinin ardından aynı gönüllülere çalışma protokolünde belirlenen ve birinci aşamada da uygulanan standart koşullarda, birinci aşamada test ilacı alan gönüllüye referans ilaç, referans ilacı alan gönüllüye test ilaç verilir. İlacın kinetiğini etkileyecek her türlü etken minumuma indirgenecek şekilde çalışmalar tasarlanmaktadır. Bu etkenler; ilacın metabolizasyonunu etkileyen yiyecekler, fiziksel aktivite, sigara, alkol, heyecan vb'dir.

Bu çalışmada iki periyod arasında ilacın kandan tamamen temizlenmesi için 14 günlük bir ilaçtan arınma zamanı bırakılmıştır. Her bir periyot da toplam 72 saat süresince 18 örnek alınmış ve plazmadaki olmesartan miktarı ölçülmüştür. İlaç uygulama dozu olarak belirlenen 40 mg olmesartan medoksomil içeren tablet, 72 saat içinde ölçülebilir plazma konsantrasyonunu sağlamaktadır. 40 mg olmesartan medoksomil içeren test ve referans tabletler, randomizasyon tablosundaki sıraya uygun olarak, uygulama günü sabahı aç karnına ve oral yol ile uygulanmıştır. Çalışma planında belirtildiği şekilde ilaç uygulamasından hemen önce (0), ilaç uygulamasından sonra 0.33, 0.66, 1.0, 1.25, 1.50, 1.75, 2, 2.33, 2.66, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72. saatlerde kan örnekleri (8 ml) alınmıştır. Alınan kan örnekleri 20 dakika içinde 3000 rpmde 10 dakika santrüj edilerek plazma ayrılmıştır. Plazma örnekleri laboratuvara nakil edilene kadar -80°C'lik derin dondurucu içinde saklanmıştır. Gönüllüler advers etkiler bakımından çalışma süresince araştırıcılar tarafından gözlemlenmiştir.

Biyoeşdeğerlik çalışmalarında istenilen istatistiksel gücü mümkün olan en küçük katılımcı grubuyla sağlaması gerkliliği göz önüne alınarak çapraz geçişli tasarım tercih edilmiş ve tasarımın gereği olarak çalışmada istenilen istatistiksel gücü sağlamak için her katılımcı kendi kontrolü olarak kullanılmıştır.

Numune Analizi
-80°C'de saklanan etiketli polipropilen tüpler, T.C. Yeditepe Üniversitesi İLU Laboratuvarı'na nakil edilmiştir. Olmesartanın plazmadaki konsantrasyonlarının ölçümü, yüksek performanslı sıvı kromatografisi- kütle spektrofotometresi (HPLCMS) sistemi ve Gemini C18 (4.6x150mm, 5μm) (Phenomenex- USA) analitik kolon kullanılarak uygulanmıştır.

Cihaz analizinden önce, 1 ml plazmadan katı faz ekstraksiyonu ile olmesartan alınmıştır. Plazma numuneleri, analizi gerçekleştirilene kadar -80°C'lik derin dondurucu da bekletilmiştir. İç standart olarak valsartan kullanılmıştır. Numuneler Waters OASIS HLB 30 mg/96 well plate ile katı faz ekstraksiyonu ardından mobil faz ile rekonstitüe edilerek LC-MS/MS sistemine 5 μL enjekte edilmiştir.

Kromatografik Şartlar LC-MS sistemi, bir adet dörtlü pompa, bir adet oto örnekleyici, bir adet termostatlı kolon fırını, 1 adet MS/MS dedektöründen oluşmaktadır.[5,6] Analitik ayırım Gemini C18 (4.6x150mm, 5μm) kolonu kullanılarak yapılmıştır. Mobil faz izokratik olarak metanol: %0.05 Formik Asit: Asetonitril; 15:35:50 karışımından oluşmaktadır. Mobil faz akış hızı 0.5 mL/dakika olarak belirlenmiştir. Dedektör, Olmesartan için m/z: 445.15>149.30 ve Valsartan için m/z: 434.20>179.30'a ayarlanmıştır. Analiz çalışma süresi 15 dakika'dır. Olmesartan numunelerinin 2-2000 ng/mL konsantrasyon aralığında integrasyon değerleri sabit olarak kullanılmıştır.

İstatistiksel yöntem
Farmakokinetik Analizler
Plazma konsantrasyonlarının ölçülmesinden sonra farmakokinetik parametrelerin hesaplanması standart nonkompartmental metot kullanılarak yapılmıştır. Çalışma kapsamında katılımcılardan alınmış olan kan numunelerin analizi ile elde edilen zamana karşı ilaç konsantrasyonu değerleri farmakokinetik parametrelerin hesaplanmasında kullanılmıştır. Farmakokinetik parametrelerin hesaplanması, Pharsight tarafından üretilen WinNonlin nonlineer modelleme yazılımının 5.0.1 versiyonu yardımıyla yapılmıştır. Test ve referans ürün arasındaki biyoeşdeğerliğin sınanması amacıyla uygulanmış olan varyans analizinin (ANOVA) uygulaması için aynı yazılım kullanılmıştır.

GEREÇLER
40 mg Olmesartan içeren iki film kaplı tablet formülasyonunun sağlıklı katılımcılarda, açık etiketli, randomize, tek-doz, iki periyotlu çapraz geçişli biyoeşdeğerlik çalışması olan bu çalışmada test (Neutec Ar-Ge Sanayi ve Ticaret Anonim Şirketi, Türkiye, seri no: 3030) ve referans (Olmetec®, Daiichi- Sankyo, Almanya, seri no: 118741) tabletler kullanılmıştır.

Çalışmada kullanılan başlıca reaktifler ve kaynakları (reaktif; kaynak) metanol, asetonitril, formik asit; Sigma Aldrich ve deiyonize su; Sartorius Arium olarak kullanılmıştır.

Ekipman
Çalışmada kullanılan HPLC sistemi; Agilent 1100 seri dörtlü pompa (G1311A), Agilent 1100 seri oto örnekleyici (G1329A) ve MS sistemi; Waters Quattro Micro API Micromass QAB1496 MS/MS sistemlerinden oluşmaktadır. Sistem MassLynx V 4.1 yazılımı ile çalışmaktadır. Analitik kolon olarak Gemini C18 (4.6x150mm, 5μm) (Phenomenex, USA) kullanılmıştır.

Reference

1) Guideline On Investigation of Bioequivalence. 2008 EMEA; p 9-10 http://www.ema.europa.eu/docs/en_ GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/ WC500003011.pdf.

2) Farmasötik Müstahzarların Biyoyararlanım ve Biyoeşdeğerliliğinin Değerlendirilmesi Hakkında Yönetmelik. Resmi Gazete 27 Mayıs 1994, No: 21942.

3) Kerins, DM, Robertson RM, Robertson D. Drugs Used For The Treatment Of Myocardial Ischemia. In, Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Ed. Editors: Hardman JG, Limbird LE, McGraw Hill, Int.Ed.,2001, pp.864.

4) Brunner HR, Olmesartan medoxomil: current status of its use in monotherapy.Vasc Health Risk Manag 2006;2(4): 327-40.

5) Vaidya VV, Roy SMN, Yetal SM, Joshi SS, Parekh SA. LC-MS-MS determination of Olmesartane in human plasma. Chromatographia 2008;67: 147-150.

6) Liu DY, Hu P, Matsushima N, Li XM, Li L, Jiang J. Quantitative Determination Of Olmesartane in Human Plasma and urine by Liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. J of Liquid Chromatog B 2007;856: 190-197.

Marmara University