2Marmara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Biyokimya AD, İstanbul, Türkiye DOI : 10.12991/201115440
Summary
Kesilmiş sütün sıvı kısmı olan süt serumu (whey) sütün tedavi edici etkilerinden sorumlu tutulmaktadır. Peynir yapımı sırasında sütten ayrılan ve süt serumu veya ‘peynir altı suyu' olarak da adlandırılan sıvının süt serumu proteinlerince zengin olduğu bilinmektedir. Bu yan ürün gıda endüstrisinde toz haline getirilerek kullanılmakta ve peynir altı suyu tozu (PAST) olarak adlandırılmaktadır. Çalışmalarımızda iki farklı yöntemle elde edilmiş süt serumu örnekleri kullanıldı. Birincisi günlük, taze ve pastörize edilmemiş inek sütünden elde edilen süt serumu, diğeri ise peynir yapımı sırasında elde edilen ve liyofilize edilerek endüstriyel bir gıda ürünü olarak satılan peynir altı suyu tozu (PAST) idi. Çalışmamızda bu ürünlerin, bakır ile oksidasyonu indüklenmiş insan serumunda lipit peroksidasyonuna ve protein oksidasyonuna olan etkisinin karşılaştırılması amaçlandı. Deneylerimizde; süt serumu proteinlerinde total ve serbest –SH grubu ölçümü, serumda lipit peroksidasyonu ölçümü (TBARS ve Dien Konjugasyon yöntemleriyle) ve serumda protein oksidasyonu ölçümü (protein karbonilleri) yöntemleri kullanıldı. Bu örneklerin protein miktarları Bradford yöntemi ile belirlendi. Sonuç olarak, PAST ve çiğ süt serumunun okside serum üzerine direk antioksidan etkisi olduğu ve bu etkinin içerdikleri –SH grubu miktarı ile ilişkili olduğu saptandı. –SH miktarı daha yüksek olan PAST'ın çiğ süt serumundan daha güçlü antioksidan etkiye sahip olduğu görüldü.Introduction
Beslenmenin genel sağlık durumuna etkisini, özellikle de bazı gıdaların tedavi edici etkilerini aydınlatabilmek için son yıllarda giderek artan sayıda araştırma yapılmaktadır. Süt, hastalık tedavi edici nitelik taşıdığı düşünülen gıdalar arasında öne çıkmakta ve özellikle sütün ‘süt serumu’ fraksiyonunun bu etkinin asıl sorumlusu olduğu öne sürülmektedir. Süt serumu β-laktoglobulin, α-laktalbumin, serum albumin, ve immunoglobulinlerden oluşan bir protein karışımıdır. Çok sayıda çalışmada süt serumunun çok yönlü terapötik etkileri aydınlatılmış ve bu protein karışımının antikanserojen ve serbest radikal hasarını önleyen etkileri öne çıkmıştır[1,2].Süt serumu, kazeini içeriği çöktürülmüş sütün sıvı kısmı olarak tanımlanabilmekle beraber, aslında peynir yapımı sırasında elde edilen bir yan üründür[3]. İngilizce terminolojide ‘whey’ olarak adlandırılan bu ürünün dilimizdeki karşılığı ‘süt serumu’ veya ‘peynir altı suyu’dur. Peynir altı suyunun liyofilize edilerek toz haline getirilmiş şekli (peynir altı suyu tozu-PAST) gıda endüstrisinde kullanılmaktadır.
Serbest radikaller hücre ve dokularda bir çok zarara yol açarak, akut ve kronik hastalıkların etiyolojisinde önemli bir rol oynarlar. Bu nedenle hastalık tedavisi için organizmanın kendi antioksidan kapasitesini güçlendirecek çözümler bulmak günümüzde çok sayıda bilimsel araştırmanın ana hedefidir. Süt serumu proteinlerinin antikanserojen ve bağışıklığı destekleyen etkileri çok sayıda in vivo araştırmada bildirilmiştir. Bu bulgular nedeniyle süt serumu proteinlerinin hastalık tedavisini destekleyen etkileri, organizmadaki antioksidan kapasiteyi bir yolla arttırmasıyla açıklanmaya çalışılmıştır. En çok üzerinde düşünce birliği olan hipotez, süt serumu proteinlerinin organizmada glutatyon (GSH) düzeyini arttırarak antioksidan etki gösterdiği düşüncesidir[2,4,5]. Aynı hipotez üzerinde planlanan in vitro çalışmalarda ise süt serumu proteinlerinin çeşitli yağ emülsiyonlarında lipit peroksidasyonunu gerilettiği gösterilmiştir[6,7].
Çalışmamızda süt serumu proteinlerinin antioksidan etkilerini in vitro koşullardaki bulgularımızla aydınlatmayı hedefledik. Endüstriyel bir yan ürün olan PAST ile taze çiğ sütten elde ettiğimiz süt serumu örneklerinin in vitro etkilerini de birbirleriyle karşılaştırdık. PAST ve çiğ süt serumu örneklerinin serbest sülfidril (-SH) gruplarının miktarlarını belirledikten sonra ısıtılmış örneklerde –SH miktarında bir değişim olup olmadığını araştırdık. Aynı örneklerin sağlıklı insan serumunda bakır ile uyarılan lipit peroksidasyonunu ve protein oksidasyonunu ne yönde etkilediğini ve ısıtma işleminin örneklerdeki antioksidan etkinliği ne şekilde değiştireceğini araştırmayı hedefledik.
Methods
Çalışmalarımızda iki farklı yöntemle elde edilmiş süt serumu örnekleri kullanıldı. Birincisi günlük, taze ve pastörize edilmemiş inek sütünden elde edilen süt serumu, diğeri ise peynir yapımı sırasında elde edilen ve liyofilize edilerek endüstriyel bir gıda ürünü olarak satılan peynir altı suyu tozu (PAST) idi.
Süt serumu proteinlerinin çiğ inek sütünden eldesi
Çalışmamızda, çiğ inek sütünden öncelikle kazein fraksiyonu
asitle çöktürüldü ve sonra diyaliz uygulanarak süt serumu
elde edildi. Protein saflaştırmasında uygulanan bir yöntem
olan diyaliz yönteminde, protein çözeltisi yarı-geçirgen bir
membran torba içine doldurulur. Bu membran uygun derişimde
bir tampon içine yerleştirildikten sonra, küçük moleküller
membrandan geçerek tampon ortamına karışırken, membrandan geçemeyen büyük moleküller torba içinde yoğunlaşırlar.
Elde edilen süt serumu –20 °C’de korundu[8].
PAST’daki süt serumu proteinlerinin çözelti haline
getirilmesi
Kazein dışındaki süt proteinlerini içeren peyniraltı suyu peynir
yapımı sırasında yan ürün ve atık olarak oluşmaktadır.
Bahçıvan Gıda Sanayi ve Ticaret A. Ş.’den temin edilen
PAST’dan PBS (pH 7.4) ile % 5 ’lik, % 10’luk ve %20’lik çözeltiler hazırlandı. Ön denemelerden sonra, deneylerimiz için
uygun konsantrasyonun % 5 olduğuna karar verildi.
PAST çözeltisi ve çiğ süt serumunun artan sıcaklıklarda
ısıtılması
Süt serumu proteinlerinin artan sıcaklıklarda ısıtılmasının, antioksidan
özellikleri üzerine etkisini aydınlatabilmek için, deneylerimizde
çiğ süt serumu ile % 5’lik PAST çözeltisi örnekleri
15’er dakika süre ile 50, 60, 70 ve 80°C sıcaklıktaki su banyosunda
ısıtıldı. Sonraki deneylerde bu örnekler de kullanıldı.
Bradford yöntemi ile protein tayini
Süt serumu örneklerimizdeki protein tayini, Bradford yöntemi
ile yapıldı. Oldukça duyarlı olan bu yöntem (5-100 mg/ml);
organik boyaların, proteinlerin asidik ve bazik grupları ile etkileşerek,
renk oluşturmasını esas alır. Sonuç hesaplaması, sığır
serum albumini ile hazırlanan standart eğrisinden yararlanılarak
yapıldı[9].
Protein sülfidril (–SH) gruplarının tayini
Örneklerimizdeki serbest ve total –SH grupu tayini, Ellman
metodunun bir modifikasyonu ile gerçekleştirildi. Ekstinksiyon
katsayısı (e=13.600 M.L-1.cm-1 ) kullanılarak hesaplandı,
sonuçlar mmol/L olarak ifade edildi[10,11].
Süt serumu proteinlerinin, CuSO4 ile indüklenen serum lipit
peroksidasyonuna etkisinin TBARS yöntemi ile ölçümü
Cu+2’ın plazma lipoproteinleri için bir oksidan olmasından yararlanılarak
CuSO4 ile okside edilmiş serum veya plazma örneğinde
TBARS değerinin süt serumlarının varlığında değişimini
spektrofotometrik olarak 535 nm’de incelendi. Sağlıklı taze insan
serumu, PAST’nun 0.5 M PBS (pH 7.4) içinde hazırlanmış % 5’lik çözeltisi, çiğ süt serumu ve her iki örneğin 50, 60, 70, ve
80°C’de ısıtılmış örnekleri taze olarak kullanıldı[12,13].
Süt serumu proteinlerinin serumda dien konjugasyona
etkisi
Lipit hidroperoksitlerindeki konjuge dien yapılarının 234
nm’deki absorbanslarının zamana karşı ölçümü, lipoprotein
oksidasyonunun karakterize edebilen kullanışlı bir yöntemdir.
Deneylerimizde taze sağlıklı insan serumu, 0,5 M PBS
(pH=7.4) ile % 0.67 oranında sulandırılarak dien konjugasyon
ölçümleri yapıldı[14,15].
Süt serumu proteinlerinin protein oksidasyonuna etkisi
Süt serumu proteinlerinin antioksidan etkilerini daha geniş
çerçevede değerlendirebilmek için bu proteinlerin serumdaki
protein oksidasyonuna olan etkisi de araştırıldı. % 5’lik PAST
çözeltisi ve çiğ süt serumu örnekleri ve taze insan serumu 1/10
oranında sulandırılarak kullanıldı[16,17].
Results
Çiğ süt serumu ve % 5’lik PAST çözeltisinin protein, serbest ve total –SH ölçümleri yapıldı. % 5’lik PAST .çözeltisinin protein miktarı 95 g/l, çiğ süt serumunun ise 227.2 g/l olarak belirlendi . Çiğ süt serumununun % 5’lik PAST çözeltisinden daha fazla miktarda protein içermesine karşın, gram protein başına daha az –SH grubu içerdiği görüldü. Total –SH ölçümleri sonucunda % 5’lik PAST çözeltisinde 0.7 mmol/g. protein, çiğ süt serumunda ise 0.57 mmol/g. protein –SH bulunduğu belirlendi. Ayrıca 50, 60, 70 ve 80°C sıcaklıklarda ısıtılmış örneklerin serbest –SH ölçümleri yapıldı. Isıtma işleminin örneklerdeki serbest–SH miktarını arttırdığı görüldü (Tablo 1).
% 5’lik PAST çözeltisinin ve ısıtılan örneklerinin okside serumda
lipit peroksidasyonuna ve protein oksidasyonuna etkisi
CuSO4 ile okside edilen serumda %5’lik PAST çözeltisinin lipit
peroksidasyonu ve protein oksidasyonunu kontrole göre belirgin
biçimde gerilettiği görüldü. PAST örneklerimizin serumda
lipit peroksidasyonuna olan etkisi hem TBARS hem de
dien konjugasyon oluşumunun baskılanması ile belirgin şekilde
saptanırken, ısıtılmamış (25°C), 50 ve 60°C ısıtılmış örneklerin
etkilerinin birbirlerine oldukça yakın olduğu gözlendi. 70
ve 80°C’de ısıtılan örneklerin, lipit peroksidasyonuna olan etkisinin
serbest –SH değişimine benzer biçimde arttığı saptandı.
Üç saat süresince yapılan lipit peroksidasyon ölçümlerinde
PAST örneklerinin antioksidan etkisi 120. dakika itibariyle
daha da belirginleşti. PAST örneklerinin serum lipit peroksidasyon
(TBARS) ve dien konjugasyon olan etkisi Şekil 2 ve
Şekil 3’de grafiklerle gösterilmiştir.
ŞEKİL 1: Bakır ile serum oksidasyonunun genel uygulama diyagramı
ŞEKİL 3: %5’lik PAST çözeltisinin ve ısıtılan örneklerinin okside serumda dien konjugasyonuna etkisi
PAST örneklerinin okside serumda protein oksidasyonuna olan etkisi incelendiğinde, PAST örneklerinin serum protein oksidasyonunu baskıladığı, 70 ve 80°C ısıtılan örneklerde bu etkinin en yüksek düzeyde olduğu belirlendi. Şekil 4’de PAST örneklerinin serum protein oksidasyonuna olan etkisi grafikle gösterilmiştir. Tüm örneklere ait ölçümler 4 kez tekrarlanıp, hesaplanan ortalama değerlerle grafikler oluşturulmuştur.
Çiğ süt serumunun ve ısıtılan örneklerinin okside serumda
lipit peroksidasyonuna ve protein oksidasyonuna etkisi
CuSO4 ile okside edilen serumda çiğ süt serumunun serum lipit
peroksidasyonu ve protein oksidasyonunu kontrole göre
belirgin biçimde baskıladığı görüldü. Isıtılan örneklerde uygulanan
sıcaklık arttıkça (70 ve 80°C’de en belirgin şekilde), lipit
peroksidasyonuna olan etkinin serbest –SH değişimine benzer
biçimde arttığı saptandı. Serum protein oksidasyonuna olan
etki sıcaklık artışı ve –SH artışına çok fazla paralel olmamakla birlikte 70 ve 80°C ısıtılmış örneklerde 180. dakikada en yüksek
düzeyde saptandı. Çiğ süt serumunun lipit peroksidasyonunu
ve protein oksidasyonunu baskılayan etkisinin, % 5’lik
PAST çözeltisine kıyasla daha az olduğu görüldü. Şekil 5 ve
Şekil 6’da çiğ süt serumu örneklerinin serum lipit peroksidasyon
ve dien konjugasyonuna etkisi, Şekil 7 ’de ise serum protein
oksidasyonuna etkisi grafiklerle gösterilmiştir. Tüm örneklere
ait ölçümler 4 kez tekrarlanıp, hesaplanan ortalama
değerlerle grafikler oluşturulmuştur.
ŞEKİL 6: Çiğ süt serumunun ve ısıtılan örneklerinin okside serumda dien konjugasyon oluşumuna etkisi
ŞEKİL 7: Çiğ süt serumunun ve ısıtılan örneklerinin okside serumda protein oksidasyonuna etkisi
Reference
1) Ewan H, Zemel MB. Functional properties of whey,
whey components, and essential amino acids: mechanisms
underlying health benefits for active people. J.
Nutr. Biochem, 14: 251-258, 2003.
2) Bounous G, Batist G, Gold P. Immunoenhancing property
of dietary whey protein in mice: role of glutathione.
Clin Invest Med, 12: 154-161, 1989.
3) Ensminger AH, Ensminger ME, Konlande JE, Robson JRK.
Milk and milk products. The Concise encylopedia of foods
and nutrition. s. 691-710, CRC Press Inc, U.S.A, 1995.
4) Bounous G. Whey protein concentrate (WPC) and glutathione
modulation in cancer treatment. Anticancer Res,
20: 4785-4792, 2000.
5) Flagg EW, Coates RJ, Eley W et al. Dietary glutathione
intake in humans and the relationship between intake
and olasma total glutathione level. Nutr Cancer, 21: 33-
39, 1994.
6) Ramos EAP, Xiong YL. Antioxidative activity of whey
protein hydrolysates in a liposomal system. J Dairy Sci,
84: 2577-2583, 2001.
7) Ramos EAP, Xiong YL. Whey and soy protein hydrolysates
inhibit lipid oxidation in cooked pork patties. Meat
Sci, 64: 259-263, 2003.
8) Harris ELV, Angal S. Protein purification methods. A
practical approach. s. 30-55, IRL Press, Oxford, 1989.
9) Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation
of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72:
248-254, 1976.
10) Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arc Biochem Biophys,
82: 70-77, 1959.
11) Patrick PS, Swaisgood HE. Sulfhydryl and disulfide groups
in skim milk as affected by direct ultra-high temperature
heating and subseguent storage. J Dairy Sci, 59:
594-600, 1975.
12) Janisch K, Hippeli S, Dornisch K, Kern S, Elstner EF. Determination
of the antioxidative potential of human plasma
after supplementation with pycnogenol and whey.
Food Res Int, 35: 257-266, 2002.
13) Zhang A, Vertommen J, Van Gaal L, De Leeuw I. A rapid and simple method for measuring the susceptibility of
low-density-lipoprotein and very-low density lipoprotein
to copper-catalyzed oxidation. Clin Chim Acta, 227:
159-173, 1994.
14) Kontush A., Beisiegel U.: Measurement of oxidizability
of blood plasma. Meth Enzymol, 299: 35-49, 1999.
15) Nyyssönen K, Sarataho EP, Kaikkonen J, Salonen JT. Ascorbate
and urate are the strongest determinants of plasma
antioxidative capacity and serum lipid resistance to
oxidation in Finnish men. Atherosclerosis, 130: 223-233,
1997.
16) Haklar G, Erşahin Ç, Moini H et al. Protective effects of
cilazapril against free radical injury in myocardial ischaemia
–reperfusion. Pharmacol Res, 31: 33-36, 1995.
17) Levine RL, Garland D, Oliver CN et al. Determination of
carbonyl content in oxidatively modified proteins. Meth
Enzymol, 186: 465-478, 1990.
18) Lindmark-Mansson H, Akesson B. Antioxidative factors
in milk. Br J Nutr, 84: 103-110, 2000.
19) Buttriss J, Milk ED, Macrae R et al. Encyclopaedia of food
science, food technology, and nutrition. Vol: 5, s. 3066-
3090, Academic Press, London, San Diego, 1993.
20) Bounous G, Kongshavn PAT. The effect of dietary amino
acids on immune reactivity. Immunology, 35: 257-266,
1978.
21) Bounous G, Kongshavn PAT. Differential effect of dietary
protein type on the B-Cell and T-Cell immune responses
in mice. J Nutr, 115: 1403-1408, 1985.
22) Bounous G, Letourneau L, Kongshavn PAL. Influence of
dietary protein type on immune system of mice. J Nutr,
113: 1415-1421, 1983.
23) Bounous G, Papenburg R, Kongshavn P et al. Dietary
whey protein inhibits the development of dimethylhydrazine
induced malignancy. Clin Invest Med,
11: 213-217, 1988.
24) Cervato G, Cazzola R, Cestaro B. Studies on the activity
of milk caseins. Int J Food Sci Nutr, 50: 291-296, 1999.
25) He F, Tuomola E, Arvilommi H, Salminen S. Modulation
of human immune response through orally administered
bovine colostrum. FEMS Immunol Med Microbiol,
31: 93-96, 2001.
26) Low PPL, Rutherfurd KJ, Gill HS, Cross ML. Effect of dietary
whey protein concentrate on primary and secondary
antibody responses in immunized BALB/c mice.
Int Immunopharm, 3: 393-401, 2003.
27) Micke P, Beeh KM, Buhl R. Effects of long-term supplementation
with whey proteins on plasma glutathione levels
of HIV-infected patients. Eur J Nutr, 41: 12-18, 2002.
28) Bounous G, Baruchel S, Falutz J, Gold P. Whey proteins
as a food supplement in HIV seropositive individuals.
Clin Invest Med, 16: 204-209, 1993.
29) Middleton N, Reid JR, Coolbear T, Jelen P. Proliferation
and intracellular glutathione in Jurkat Tcells with concentrated
whey protein products. Int Dairy J, 13: 565-573,
2003.
30) Tsuda H, Sekine K, Ushida Y et al. Milk daiıry products
in cancer prevention: focus on bovine laktoferrin. Mutat
Res, 462: 227-233, 2000.
31) Belobrajdic DP, McIntosh GH, Owens JA. Whey proteins
protect more than red meat against azoxymethane induced
ACF in Wistar rats. Cancer Lett, 198: 43-51, 2003.
32) Tsai WY, Chang WH, Chen CH, Lu FJ. Enhancing effect
of patented whey protein isolate (Immunucal) on cytotoxicity
of an anticancer drug. Nutr Cancer, 38: 200-208, 2000.
33) Taylor JM, Richardson T. Antioxidant activity of skim
milk: Effect of heat and resultant sulfhydryl groups. J
Dairy Sci, 63: 1783-1795, 1980.
34) Alting AC, Hamer RJ, Kruif CG et al. Number of thiol
groups rather than the size of the aggregates determines
the hardness of cold set whey protein gels. Food Hydrocol,
17: 469-479, 2003.