2Yeditepe Üniversitesi, Tıbbi Mikrobiyoloji-İmmunoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye DOI : 10.12991/201115442
Summary
Gama-glutamiltransferaz (GGT), indirgenmiş glutatyonun (GSH) metabolizmasında önemli rol oynayan bir membran enzimidir. GSH'ın katabolizması sırasında, GGT aktivitesi sonucu güçlü demir redükleyici etkisi olan tiyol dipeptid sisteinilglisin oluşur. Son araştırmalar artmış serum GGT aktivitesinin oksidatif stresin bir göstergesi olarak kullanılabileceğini göstermektedir. GGT aktivitesi trombositlerde de bulunur. Redoks reaksiyonları trombosit fonksiyonlarını değiştirebilir. Ancak, trombositlerdeki redoks reaksiyonlarında GGT aktivitesinin rolü bilinmemektedir. Bu çalışmanın amacı trombosit-GGT aktivitesinin demir(III) varlığında, oksidatif modifikasyonları ve apoptotik uyarıları başlatıcı etkisinin olup olmadığını belirlemektir. Çalışmamızda, trombosit GGT aktivitesi demir(III) varlığında inhibitörlerle inhibe edildikten sonra ve/veya substratları ile uyarıldıktan sonra lipid peroksidasyonu, protein oksidasyonu, GSH, kaspaz-3 düzeyleri ve fosfatidilserin (PS) translokasyonu incelenmiştir. Sonuçlar, demir (III) varlığında GGT aktivitesi uyarılan trombositlerin lipid peroksidasyonu ve protein oksidasyonu düzeylerinin GGT aktivitesi inhibe edilen trombositlere göre anlamlı olarak daha yüksek düzeylerde olduğunu göstermiştir. GGT aktivitesi uyarılan trombositlerin GSH içeriği anlamlı ölçüde azalmıştır. Trombositlerin kaspaz-3 aktivitelerinde anlamlı farklılık gözlenmemiştir. Ancak, GGT aktivitesi uyarılan trombositlerde PS translokasyonu, GGT aktivitesi inhibe edilen trombositlere göre erken apoptoz-aktivasyon fazında artmıştır. Sonuç olarak, trombosit-GGT/GSH/demir(III) sistemi trombositlerde oksidatif modifikasyonları ve trombosit PS translokasyonunu tetikleyebilir. Böylece, trombosit-GGT'si bulunduğu çevrede reaktif oksijen türlerinin (ROT) artışına katkıda bulunabilir ve kardiyovasküler hastalıkların gelişiminde rol oynayabilir.Introduction
Gamma-glutamil transferaz (GGT, EC 2.3.2.2) hücre membranın dış yüzeyinde bulunan ektoaktiviteye sahip bir enzimdir. GGT'nin ana fonksiyonu hücre membranından bütün halde geçişi güç olan ekstrasellüler indirgenmiş glutatyonun (GSH) hidrolizidir. Böylece hücre içinde yeniden GSH sentezi için gerekli sisteini sağlayarak GSH hemostazında önemli rol oynar ve antioksidan etki gösterir[1,2]. GSH diğer hücrelerde olduğu gibi trombositlerde de oksidatif strese karşı savunmada ve redoks reaksiyonlarının düzenlenmesinde kritik rol oynar. GSH ve okside glutatyon (GSSG) oranındaki dengenin bozulması sıklıkla kardiovasküler hastalıklar gibi trombosit aggregasyonu ve aktivasyonun bozulduğu durumlara eşlik eder[3,4].Son yıllarda özellikle hücre kültürleri ile yapılan çalışmalar GGT tarafından GSH'ın hidrolizi sırasında ve demir, bakır gibi geçiş metallerinin varlığında reaktif oksijen türlerinin oluşabileceğini de göstermiştir[2,5,6]. GSH'ın GGT tarafından hidrolizi sırasında oluşan ana metabolit sisteinilglisinin -SH grubunun kuvvetli redükleyici etkisi bu durumdan sorumlu tutulmaktadır. Normalde sistein ve sisteinilglisinin yapısında bulunan -SH gruplarının da antioksidan özelliği olduğu bilinmektedir. Sisteinilglisinin -SH grubu ortamın pH değerlerine bağlı olarak kolaylıkla tiyolat anyonuna dönüşebilir. Oluşan tiyolat anyonu demir gibi geçiş metallerinin varlığında reaktif oksijen türlerinden (ROT) biri olan tiyil radikalinin (-S•) oluşmasına yol açar. Olusan tiyil radikali ferrik demiri (Fe III) ferröz demire (Fe II) indirgeyerek Fenton reaksiyonu ile ROT'ların oluşmasına neden olabilir[7,8].
Fizyolojik ve patolojik şartlarda açığa çıkan ROT'lar trombosit fonksiyonlarında önemli rol oynar. Trombositler dolaşımda diğer kaynaklardan açığa çıkan ROT'ların yanında kendi ürettikleri için de hedef hücrelerdir. Endojen olarak trombosit aktivasyonu sırasında üretilen süperoksit anyonu (O2•-) ve hidrojen peroksit (H2O2) gibi ROT'lar otokrin ve parakrin olarak etki gösterirler[3,4]. İntraselüler ve ekstraselüler ROT üretiminin artması redoks dengesinin bozulmasına neden olarak hücreleri apoptoz veya nekroza yönlendirebilir[8].
Apoptoz çekirdekli hücrelerde gözlenen programlanmış hücre ölümüdür. Çekirdek içermemelerine karşın trombositlerde apoptotik göstergeler (normalde hücre membranının iç yüzeyinde yer alan bir fosfolipid olan fosfatidil serinin hücre membranının dış yüzeyine hareketi (translokasyonu), kaspazApoptoz çekirdekli hücrelerde gözlenen programlanmış hücre ölümüdür. Çekirdek içermemelerine karşın trombositlerde apoptotik göstergeler (normalde hücre membranının iç yüzeyinde yer alan bir fosfolipid olan fosfatidil serinin hücre membranının dış yüzeyine hareketi (translokasyonu), kaspazların aktivasyonu, mikropartikül oluşumu gibi) belirlenmiştir[9].
Bu çalışmada demir(III) varlığında, trombosit GGT aktivitesinin eksojen GSH ilavesi ile uyarılmasının trombositlerde oksidatif değişikliklere, trombosit apoptozuna ve trombosit aktivasyonuna etkisi araştırılmıştır.
Methods
Çalışmamızda sağlıklı, gönüllü 12 kişiden alınan kanlardan elde edilen trombositler kullanılmıştır. Çalışmaya alınan kişilerin son 10 gün içinde trombosit fonksiyonlarını etkilediği bilinen bir ajana maruz kalmamış olmasına özen gösterildi. Çalışma için, Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Kurulu'ndan B.30.2.MAR.0.01.02/AEK/983 sayı ile onay alınmıştır. Deneylerde kullanılan kimyasallar Sigma (St. Louis, MO, USA) ve Merck (Darmstadt, Germany) firmasının ürünleridir.
Trombositlerin ayrılması
Çalışmamızda, trombositler aferez yöntemi ayrıldıktan sonra
5000 rpm'de 15 dakika 22ºC ‘de santrifüj edilerek çöktürüldü.
Çöken trombositler Tris-NaCl-EDTA (0.03 M Tris, 0.12 M
NaCl, pH: 7.4; 5 mM EDTA, 1 U/ml apiraz içeren) tamponu ile
süspande edilerek yıkandı. Santrifüj sonrası tamponda (0.03 M
Tris; 0.12 M NaCl, 5mM glukoz, pH:7.4) süspande edilerek
analizler için kullanıldı.
GGT aktivitesinin inhibisyonu
GGT aktivitesini inhibe etmek için GGT'nin geri dönüşümsüz
inhibitörü olan akivisin ve spesifik geri dönüşümlü yarışmalı
inhibitörü olan L-serin/borik asit karışımı (SBC) olmak üzere
etki mekanizmaları farklı iki inhibitör kullanıldı[1]. İnhibitörler, 500 μM akivisin veya SBC (5 mM L-serin/10mM borik asit)
1ml Tris-NaCI tamponu ile süspande edilmiş trombositlere
ilave edilerek 37 °C'de 15 dakika bekletildi. İnkübasyon sonrası
örneklerde GGT aktivitesi tayin edilerek[10] inhibisyon
oranları belirlendi. GGT aktivitesinin tayini için substrat olarak
gama-glutamil p-nitroanilid kullanıldı. Reaksiyon sonunda
açığa çıkan p-nitroanilinin verdiği renk 405 nm'de spektrofotometrede
okundu ve GGT aktivitesinin inhibisyon oranı %
inhibisyon olarak verildi.
Sisteinilglisin düzeylerinin belirlenmesi
İnhibitör uygulanan ve uygulanmayan örneklerde GGT aktivitesi
sonucu açığa çıkan sisteinilglisin düzeyleri belirlendi[11]. Yöntemin esası tiyol gruplarına karşı seçici özelliği olan
floresan bir madde ile (7-floro 2-benzo 2-okso 1,3-diazol 4-sülfonat,
SBDF) ile tiyol gruplarının türevlendirilmesidir. Bu
amaçla, 50 μL örnek 25 μL fosfat tamponu (PBS, pH 7.4) ve 1
mM ditiyotreitol (DTT) ile 30 dakika oda ısısında inkübe edildi.
Daha sonra örneklerin proteinleri trikloro asetik asit (TCA)
ile çöktürüldü ve üst fazları alındı. Üst fazdan alınan 50 μL örnek
üzerine 1.55 M NaOH ve 0.125 M borat tamponu (pH:9.5)
ilave edildi. Karışıma SBDF (1 g/L) ilave edilerek 60 ºC'de 60
dakika bekletildi. Daha sonra 10 μL örnek floresan detektörlü
(385 nm eksitasyon, 515 nm emisyon) ve 5 μm Kromasil C18
kolon (15cm×4.6 mm, Hi Chrom, Berkshire, UK) taşıyan HPLC
(Agilent, Mississauga, Canada) sistemine uygulandı. Mobil
faz olarak 30 mL/L metanol içeren asetik asit-asetat tamponu
(0.1 mol/L, pH 5.5) kullanıldı. Kromatografi 0.7 ml/dakika
akış hızı ve 29 ºC sıcaklık değerlerinde yapıldı. Standart olarak
ticari sistein, sisteinilglisin ve GSH kullanıldı. Standartlar kolona
ayrı ayrı ve karışım halinde enjekte edilerek sisteinilglisin
için retansiyon zamanı belirlendi. Sonuçlar μM sisteinilglisin
olarak ifade edildi.
Oksidatif parametreler için yapılan inkübasyonlar
Trombositler 5 mM glukoz içeren Tris-NaCl (0.03 M Tris, 0.12
M NaCl) tamponu içinde süspande edildi ve 1 ml'lik trombosit
süspansiyonları hazırlandı. GGT aktivitesini uyarmak için
fizyolojik substratı olan GSH (2.5 mM) ve akseptör glisilglisin
(glygly, 25 mM) kullanıldı. Demir kaynağı olarak FeCI3 (150
μM, nitroasetik asit (NTA) ile komplekslenmiş) kullanıldı. Ortama
GGT inhibitörleri ilave edilerek ve edilmeden inkübasyonlar
yapıldı. Gruplar (tüm gruplar için n:12) aşağıdaki şekilde
oluşturuldu:
1. Kontrol grubu (trombosit+tampon)
2. GSH-gly-gly grubu (trombosit+GSH+glygly)
3. Fe+GSH-glygly grubu (trombosit +demir
(III)+GSH+glygly
4. Fe+ SBC+GSH-glygly (trombosit+ demir
(III)+SBC+GSH+glygly)
5. Fe+Ac (akivisin)+GSH-glygly (trombosit+demir
(III)+akivisin+GSH+glygly)
GGT inhibitörleri (500 μM akivisin, 5/10 mM SBC) inkübasyon ortamına 15 dakika önceden ilave edildi. İnhibitör içermeyen gruplara aynı hacimde tampon ilave edilerek bekletildi. Tüm ajanların ilavesinden sonra 37°C de 45 dakika inkübasyon sonrası trombositler 1200xg'de 10 dakika santrifüj edildi. Çöken trombositler tamponda süspande edildi ve sonikasyonla patlatılarak analizler için kullanıldı.
Lipid peroksidasyonu (LPO), protein oksidasyonu ve GSH
düzeylerinin belirlenmesi
Trombosit LPO düzeyleri Beuge ve Aust'un yöntemi ile belirlendi[12]. Lipid peroksidasyonunun son ürünlerinden biri
olan malondialdehit (MDA) tiyobarbitürik asit (TBA) ile reaksiyona
girerek 532 nm'de maksimum absorbans veren renkli
bir bileşik oluşturur. Oluşan bu bileşiğin miktarı MDA ile doğru orantılıdır. Sonuçlar standart grafik kullanılarak nmol
MDA/mg protein olarak ifade edildi.
Protein oksidasyonu, protein karbonil içeriklerinin (PCO) tayini ile belirlendi. Trombosit karbonil içeriğinin ölçülmesinde Levine ve ark[13] yöntemi esas alındı. Bu yöntemin prensibi, protein karbonil grupları ile 2,4 dinitrofenil hidrazinin (DNPH) reaksiyonu sonucu oluşan kararlı hidrazon bileşiklerinin 360 nm'de spektrofotometrik olarak ölçülmesi esasına dayanır. Sonuçlar ekstinksiyon katsayısı (2200 M-1cm-1) kullanılarak nmol/mg protein olarak ifade edildi.
Trombositlerde GSH düzeyleri Mergel ve Ark[14] yöntemine göre yapıldı. Bu yöntemde, hafif alkali ortamda, 5,5 ditiyobis 2-nitrobenzoik asit (DTNB, Ellman reaktifi), ortamdaki alifatik tiyol bileşikleriyle tepkimeye girer. Tiyol başına oluşan, p-nitrofenol miktarı 412 nm'de spektrofotometrik olarak ölçüldü. Sonuçlar standart olarak GSH (5μg/ml -30μg/ml) kullanılarak hesaplandı ve μg/ml olarak ifade edildi.
Kaspaz-3 düzeylerinin ölçülmesi
Kaspaz-3 akitivitesi Chemicon kazpaz-3 kolorimetrik ölçüm
kiti (Chemicon, Temecula, CA, USA, Kat. No: APT165) kullanılarak
yapıldı. Yöntemin prensibi kaspaz-3'ün substratı olan
N-Asetil-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilid'den (Ac-DEVDpNA)
kromofor p-nitroanilinin (pNA) serbestleşmesinin
spektrofotometrik olarak ölçümü esasına dayanmaktadır.
Kaspaz-3'ü kaspaz-3 benzeri aktivite gösteren enzimlerden
ayırt edebilmek için kaspaz 3'ün spesifik inhibitörü olan
N-Asetil-Asp-Glu-Val-Asp-CHO (Ac-DEVD-CHO) kullanılarak
da ölçümler yapıldı. Reaksiyon sonunda serbestleşen
pNA'nın absorbansı ELISA okuyucusu (Thermo, Multiskan
EX, Vantaa, Finland) kullanılarak 405 nm'de ölçüldü ve sonuçlar
1 saatlik inkübasyon sonucu açığa çıkan nmol pNA/mg
protein olarak ifade edildi.
Örneklerin protein içerikleri Bradford yöntemine göre (15) tayin edildi.
Trombosit PS translokasyonunun ölçülmesi
PS'nin hücre membranının iç yüzeyinden membranın dış yüzeyine
hareketinin ölçümü için kapaklı konik tipli polipropilen
tüpler kullanıldı. Ölçüm akım sitometresinde (EPICS XLMCL,
Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) yapıldı. Öncelikle,
trombosit örnekleri tampon ile süspande edildi. 100 μl'lik
trombosit örnekleri alındı. İnhibitör ilave edilecek gruplara
akivisin veya SBC ilave edilerek 15 dakika ön inkübasyon yapıldı.
Daha sonra GGT'nin substratları olan GSH (2.5 mmol/L),
glisilglisin (25 mmol/L) ve FeCl3 (150 μM) ilave edilerek karışım
reaksiyona girmesi için 45 dakika 37 ºC'de bekletildi. İnkübasyon
sonrasında her örnek tüpü üzerine floresein izotiosiyanat
(FITC) ile işaretlenmiş anneksin-V (fosfolipidlere bağlanan
protein, 25 μg/ml) eklenerek 10 dakika soğuk ortamda
karanlıkta bekletildi. Üzerine 100 μl bağlama tamponu (10 mM
HEPES/NaOH pH:7.4; 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2 içeren)
eklenip akım sitometrisinde ölçüm yapıldı.
CaliBrite boncuklar (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) günlük kalite kontrolü için kullanıldı. Her tüpte 50.000 hücre sayıldı. Trombositlerin tespitinde FITC işaretli CD41a kullanıldı. Trombosit örnekleri akım sitometresinden geçirilirken FSCLog (Log. Forward Scatter: Boyut) ve SSCLog (Log. Side Scatter: granülarite) oranlarına göre trombositler bir kapı içine alınarak kontamine olan diğer kan hücrelerinden ayrıldılar. Hücre yüzeyine PS'nin hareketi ile floresan bir madde olan FITC ile işaretlenmiş anneksin-V ticari kit (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA, Kat. No:556547) kullanılarak anneksin-V pozitifliği gösteren apoptotik/aktive hücreler saptandı. Sonuçlar anneksin-V bağlanma yüzdeleri olarak verildi.
İstatistik Analiz
Veriler, SPSS (version 11.5, Chicago, IL, USA) programı kullanılarak
değerlendirildi. Sonuçlar ortalama ± standart sapma
olarak verilmiştir. Gruplar arasındaki istatistiksel karşılaştırmalar
‘'repeated measures ANOVA'' ve onu izleyen “Student-
Newman Keuls'' testi ile değerlendirilmiştir. Anlamlılık düzeyi
p<0.05 olarak kabul edilmiştir.
Results
GGT aktivitesinin inhibisyonuİnhibisyon çalışmaları sonucu GGT aktivitesinin 500 μM akivisin ile % 90±5.6 oranında 5/10 mM SBC ile %92± 6.8 oranında inhibe olduğu belirlendi. Şekil 1 ve 2'de görüldüğü gibi GGT aktivitesinin inhibe edildiği örneklerde sisteinilglisin düzeylerinin inhibe edilmeyen örneklere kıyasla istatistiksel olarak anlamlı düzeyde azaldığı gözlendi (p<0.001).
LPO, PCO ve GSH düzeyleri
GGT aktivitesinin GSH ile uyarılması kontrole göre trombosit
MDA düzeylerinde ve PCO içeriklerinde anlamlı bir değişikliğe
neden olmadı (Şekil 3a, 3b). Ancak demir(III) varlığında,
GSH-glygly ile GGT aktivitesinin uyarılması trombosit MDA
düzeylerini ve PCO içeriklerini, kontrol grubuna ve sadece
GSH-glygly uygulanan grubu göre istatistiksel olarak anlamlı
düzeyde artırdı (p<0.001, p<0.05, sırasıyla). GGT aktivitesinin
her iki inhibitörle de inhibisyonu trombosit MDA düzeylerinde
Fe-GSH-glygly grubuna göre anlamlı azalmaya neden oldu
(p<0.05, p<0.01 sırasıyla). İnhibitör olarak SBC kullanılan
grupta PCO düzeyleri azalırken (p<0.01) akivisin, PCO düzeylerinde
anlamlı değişikliğe neden olmadı.
Trombosit GSH içerikleri ortamda demir yokken GGT aktivitesinin GSH ile uyarılması sonucu kontrol grubuna göre anlamlı olarak artarken (p<0.001), demir varlığında kontrol düzeylerinde kalmıştır. Demir varlığında GGT aktivitesinin her iki inhibitörle inhibisyonu ile GSH düzeyleri Fe-GSH-glygly grubuna göre artış gösterdi (p<0.001, Şekil 4a).
Trombosit kaspaz-3 düzeyleri
Trombosit GGT aktivitesinin demir varlığında trombosit
apoptozuna etkisini incelemek amacıyla bir saatlik inkübasyon
sonrası kaspaz-3 düzeyleri belirlendi. Ortamda demir bulunmadan
GGT aktivitesinin uyarılması kontrol grubuna göre
anlamlı değişikliğe neden olmazken demir varlığında GGT aktivitesinin
uyarılması kaspaz-3 düzeylerinde düşük düzeyde
bir azalmaya neden oldu. Ancak bu azalma istatistiksel olarak
anlamlı bulunmadı. GGT aktivitesinin inhibisyonu (her iki inhibitörle
de) istatistiksel olarak anlamlı değişikliklere neden
olmadı (Şekil 4b).
PS Translokasyonu
Trombositler için aktivasyon/apoptoz göstergesi olan fosfatidil
serin translokasyonu FITC işaretli anneksin-V kullanılarak
akım sitometresinde ölçüldü. Demir varlığında GGT aktivitesinin
uyarılması trombositlerde erken aktivasyon/apoptozda
PS translokasyonunun artmasına neden olurken (p<0.05),
GGT'nin akivisin ve SBC ile inhibisyonu PS cevabının azalmasına
neden oldu (p<0.001, p<0.01, sırasıyla). Aktivasyon/
apoptozun geç fazında ise GGT aktivitesinin uyarılması ve inhibe
edilmesi trombosit PS cevabında değişikliğe neden olmadı
(Şekil 5, Şekil 6).
Reference
1) Yaman A. Gamma-glutamiltransferaz. Biyokimya Dergisi,
4: 27-37, 1997.
2) Whitfield JB. Gamma glutamyl transferase. Crit Rev Clin
Lab Sci, 38: 263-355, 2001.
3) Krötz F, Sohn HY, Pohl U. Reactive oxygen species: players
in the platelet game. Arterioscler Thromb Vasc Biol,
24: 1988–96, 2004.
4) Freedman JE. Oxidative Stress and Platelets. Arterioscler
Thromb Vasc Biol, 28: 11-16. 2008.
5) Paolicchi A, Tongiani R, Tonarelli P, Comporti M, Pompella
A. Gamma-glutamyl transpeptidase-dependent lipid
peroxidation in isolated hepatocytes and HepG2 hepatoma
cells. Free Radic Biol Med, 22: 853-860, 1997.
6) Dominici S, Valentini M, Maellaro E, Del Bello B, Paolicchi
A, Lorenzini E, Tongiani R, Comporti M, Pompella
A. Redox modulation of cell surface protein thiols
in U937 lymphoma cells: the role of gamma-glutamyl
transpeptidase-dependent H2O2 production and
S-thiolation. Free Radic Biol Med, 27: 623-635,1999.
7) Spear N, Aust SD. Thiol-mediated NTA-Fe (III) reduction
and lipid peroxidation. Arch Biochem Biophys, 312:
198-202,1994.
8) Pieri L, Dominici S, Del Bello B, Maellaro E, Comporti
M, Paolicchi A, Pompella A. Redox modulation of protein
kinase/phosphatase balance in melanoma cells: the
role of endogenous and gamma-glutamyltransferasedependent H2O2 production. Biochim Biophys Acta,
1621: 76-83, 2003.
9) Li J, Xia Y, Bernito AM, Coburn JP, Kuter DJ. The mechanism
of apoptosis in human platelets during storage.
Transfusion, 40: 1320-329, 2000.
10) Szasz G. A kinetic photometric method for serum
gamma-glutamyl transpeptidase. Clin Chem, 15: 124-
136, 1969.
11) Pfeiffer CM, Huff DL, Gunter EW. Rapid and accurate
HPLC assay for plasma total homocysteine and cysteine
in a clinical laboratory setting. Clin Chem, 45: 290-292,
1999.
12) Buege JA, Aust SD. Microsomal lipid peroxidation. Methods
Enzymol, 52: 302-310, 1978.
13) Levine RL, Garland D, Oliver CN, Amici A, Climent I,
Lenz AG, Ahn BW, Shaltiel S, Stadtman ER. Determination
of carbonyl content in oxidatively modified proteins.
Methods Enzymol, 186: 464-478, 1990.
14) Mergel D, Andermann G, Andermann C. Simultaneous
spectrophotometric determination of oxidized and reduced
glutathione in human and rabbit red cells. Methods
Find Exp Clin Pharmacol, 1: 277-283, 1979.
15) Bradford MM. A rapid and sensitive method for quantititation
of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein dye binding. Anal Biochem, 7: 248-
254, 1976.
16) Stark AA, Russell JJ, Langenbach R, Pagano DA, Zeiger
E, Huberman E. Localization of oxidative damage
by a glutathione-gamma-glutamyl transpeptidase
system in preneoplastic lesions in sections of livers from
carcinogen-treated rats. Carcinogenesis, 15: 343-348,
1994.
17) Enoiu M, Aberkane H, Salazar JF, Leroy P, Groffen J, Siest
G, Wellman M. Evidence fort he pro-oxidant effect
of gamma-glutamyltranspeptidase-related enzyme. Free
Radic Biol Med, 29: 825-833, 2000.
18) Paolicchi A, Minotti G, Tonarelli P, Tongiani R, De Cesare D, Mezzetti A, Dominici S, Comporti M, Pompella A.
Gamma-glutamyl transpeptidase-dependent iron reduction
and LDL oxidation-a potential mechanism in atherosclerosis.
J Investig Med, 47:151-160, 1999.
19) Aberkane H, Stoltz JF, Galteau MM, Wellman M. Erythrocytes
as targets for gamma-glutamyltranspeptidase
initiated pro-oxidant reaction. Eur J Haematol, 68: 262-
71, 2002.
20) Sener A, Özsavcı D, Yanıkkaya-Demirel G, Aksoy
H, Oba R, Uras F, Yardımcı T. The role of gammaglutamyltransferase
(GGT) activity on early platelet
apoptotic process. Turk J Hematol, 22:272, 2005.
21) Sener A, Ozsavci D, Bingol-Ozakpinar O, Cevik O,
Yanikkaya-Demirel G, Yardimci T. Oxidized-LDL and
Fe3+/ascorbic acid-induced oxidative modifications and
phosphatidylserine exposure in human platelets are reduced
by melatonin. Folia Biol (Praha), 55:45-52, 2009.
22) Law DA, Nannizzi-Alaimo L, Phillips DR. Outside-in integrin
signal transduction. Alpha IIb beta 3-(GP IIb/IIIa)
tyrosine phosphorylation induced by platelet aggregation.
J Biol Chem, 271: 10811-10815, 1996
23) Essex DW, Li M, Feinman RD, Miller A. Platelet surface
glutathione reductase-like activity. Blood, 104: 1383-1385
2004.
24) Essex DW. Redox control of platelet function. Antioxid
Redox Signal, 11:1191-1225, 2009.
25) Essex DW, Li M. Redox control of platelet aggregation.
Biochemistry, 42:129-136, 2003.
26) Sliskovic I, Mutus B. Reversible inhibition of caspase-3
activity by iron(III):potential role in phsiological control
of apoptosis. FEBS Lett, 580: 2233-37, 2006.
27) Cohen Z, Davis-Gorman G, McDonagh PF, Ritter L. Caspase
inhibition of platelet activation. Blood Coagul Fibrinolysis,
19: 305-309, 2008.
28) Trombosit apoptozu ve aktivasyonu arasındaki ilişki.
Turk J Hematol, 24: 171-176, 2007.
29) Sener A, Ozsavci D, Oba R, Demirel GY, Uras F, Yardimci
KT. Do platelet apoptosis, activation, aggregation, lipid
peroxidation and platelet-leukocyte aggregate formation
occur simultaneously in hyperlipidemia? Clin Biochem,
38: 1081-1087, 2005.
30) Leytin V, Allen DJ, Mutlu A, Mykhaylov S, Lyubimov E,
Freedman J. Platelet activation and apoptosis are different
phenomena: evidence from the sequential dynamics
and the magnitude of responses during platelet storage.
Br J Haematol, 142: 494-497, 2008.
31) Prakash M. Role of non-transferrin-bound iron in chronic
renal failure and other disease conditions. Ind J
Nephrol, 17: 188-93, 2007.
32) Halliwell B, Gutteridge JMC. The antioxidants of human
extracellular fluids. Arch Biochem Biophys, 280:
1-8, 1990.
33) Lamb DJ, Leake DS. Iron released from transferrin at acidic
pH can catalyse the oxidation of low density lipoprotein.
FEBS Lett, 352: 15-18, 1994.