Editor-in-Chief Hatice Kübra Elçioğlu Vice Editors Levent Kabasakal Esra Tatar Online ISSN 2630-6344 Publisher Marmara University Frequency Bimonthly (Six issues / year) Abbreviation J.Res.Pharm. Former Name Marmara Pharmaceutical Journal
Journal of Research in Pharmacy 2011 , Vol 15 , Num 1
The pro-oxidant effect of platelet gamma-glutamyltransferase in the presence of iron(III)
Azize Şener1, Özge Çevik1, Derya Özsavcı1, Gülderen Yanıkkaya-Demirel2
1Marmara Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye
2Yeditepe Üniversitesi, Tıbbi Mikrobiyoloji-İmmunoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye
DOI : 10.12991/201115442

Summary

Gama-glutamiltransferaz (GGT), indirgenmiş glutatyonun (GSH) metabolizmasında önemli rol oynayan bir membran enzimidir. GSH'ın katabolizması sırasında, GGT aktivitesi sonucu güçlü demir redükleyici etkisi olan tiyol dipeptid sisteinilglisin oluşur. Son araştırmalar artmış serum GGT aktivitesinin oksidatif stresin bir göstergesi olarak kullanılabileceğini göstermektedir. GGT aktivitesi trombositlerde de bulunur. Redoks reaksiyonları trombosit fonksiyonlarını değiştirebilir. Ancak, trombositlerdeki redoks reaksiyonlarında GGT aktivitesinin rolü bilinmemektedir. Bu çalışmanın amacı trombosit-GGT aktivitesinin demir(III) varlığında, oksidatif modifikasyonları ve apoptotik uyarıları başlatıcı etkisinin olup olmadığını belirlemektir. Çalışmamızda, trombosit GGT aktivitesi demir(III) varlığında inhibitörlerle inhibe edildikten sonra ve/veya substratları ile uyarıldıktan sonra lipid peroksidasyonu, protein oksidasyonu, GSH, kaspaz-3 düzeyleri ve fosfatidilserin (PS) translokasyonu incelenmiştir. Sonuçlar, demir (III) varlığında GGT aktivitesi uyarılan trombositlerin lipid peroksidasyonu ve protein oksidasyonu düzeylerinin GGT aktivitesi inhibe edilen trombositlere göre anlamlı olarak daha yüksek düzeylerde olduğunu göstermiştir. GGT aktivitesi uyarılan trombositlerin GSH içeriği anlamlı ölçüde azalmıştır. Trombositlerin kaspaz-3 aktivitelerinde anlamlı farklılık gözlenmemiştir. Ancak, GGT aktivitesi uyarılan trombositlerde PS translokasyonu, GGT aktivitesi inhibe edilen trombositlere göre erken apoptoz-aktivasyon fazında artmıştır. Sonuç olarak, trombosit-GGT/GSH/demir(III) sistemi trombositlerde oksidatif modifikasyonları ve trombosit PS translokasyonunu tetikleyebilir. Böylece, trombosit-GGT'si bulunduğu çevrede reaktif oksijen türlerinin (ROT) artışına katkıda bulunabilir ve kardiyovasküler hastalıkların gelişiminde rol oynayabilir.

Introduction

Gamma-glutamil transferaz (GGT, EC 2.3.2.2) hücre membranın dış yüzeyinde bulunan ektoaktiviteye sahip bir enzimdir. GGT'nin ana fonksiyonu hücre membranından bütün halde geçişi güç olan ekstrasellüler indirgenmiş glutatyonun (GSH) hidrolizidir. Böylece hücre içinde yeniden GSH sentezi için gerekli sisteini sağlayarak GSH hemostazında önemli rol oynar ve antioksidan etki gösterir[1,2]. GSH diğer hücrelerde olduğu gibi trombositlerde de oksidatif strese karşı savunmada ve redoks reaksiyonlarının düzenlenmesinde kritik rol oynar. GSH ve okside glutatyon (GSSG) oranındaki dengenin bozulması sıklıkla kardiovasküler hastalıklar gibi trombosit aggregasyonu ve aktivasyonun bozulduğu durumlara eşlik eder[3,4].

Son yıllarda özellikle hücre kültürleri ile yapılan çalışmalar GGT tarafından GSH'ın hidrolizi sırasında ve demir, bakır gibi geçiş metallerinin varlığında reaktif oksijen türlerinin oluşabileceğini de göstermiştir[2,5,6]. GSH'ın GGT tarafından hidrolizi sırasında oluşan ana metabolit sisteinilglisinin -SH grubunun kuvvetli redükleyici etkisi bu durumdan sorumlu tutulmaktadır. Normalde sistein ve sisteinilglisinin yapısında bulunan -SH gruplarının da antioksidan özelliği olduğu bilinmektedir. Sisteinilglisinin -SH grubu ortamın pH değerlerine bağlı olarak kolaylıkla tiyolat anyonuna dönüşebilir. Oluşan tiyolat anyonu demir gibi geçiş metallerinin varlığında reaktif oksijen türlerinden (ROT) biri olan tiyil radikalinin (-S) oluşmasına yol açar. Olusan tiyil radikali ferrik demiri (Fe III) ferröz demire (Fe II) indirgeyerek Fenton reaksiyonu ile ROT'ların oluşmasına neden olabilir[7,8].

Fizyolojik ve patolojik şartlarda açığa çıkan ROT'lar trombosit fonksiyonlarında önemli rol oynar. Trombositler dolaşımda diğer kaynaklardan açığa çıkan ROT'ların yanında kendi ürettikleri için de hedef hücrelerdir. Endojen olarak trombosit aktivasyonu sırasında üretilen süperoksit anyonu (O2•-) ve hidrojen peroksit (H2O2) gibi ROT'lar otokrin ve parakrin olarak etki gösterirler[3,4]. İntraselüler ve ekstraselüler ROT üretiminin artması redoks dengesinin bozulmasına neden olarak hücreleri apoptoz veya nekroza yönlendirebilir[8].

Apoptoz çekirdekli hücrelerde gözlenen programlanmış hücre ölümüdür. Çekirdek içermemelerine karşın trombositlerde apoptotik göstergeler (normalde hücre membranının iç yüzeyinde yer alan bir fosfolipid olan fosfatidil serinin hücre membranının dış yüzeyine hareketi (translokasyonu), kaspazApoptoz çekirdekli hücrelerde gözlenen programlanmış hücre ölümüdür. Çekirdek içermemelerine karşın trombositlerde apoptotik göstergeler (normalde hücre membranının iç yüzeyinde yer alan bir fosfolipid olan fosfatidil serinin hücre membranının dış yüzeyine hareketi (translokasyonu), kaspazların aktivasyonu, mikropartikül oluşumu gibi) belirlenmiştir[9].

Bu çalışmada demir(III) varlığında, trombosit GGT aktivitesinin eksojen GSH ilavesi ile uyarılmasının trombositlerde oksidatif değişikliklere, trombosit apoptozuna ve trombosit aktivasyonuna etkisi araştırılmıştır.

Methods

Çalışmamızda sağlıklı, gönüllü 12 kişiden alınan kanlardan elde edilen trombositler kullanılmıştır. Çalışmaya alınan kişilerin son 10 gün içinde trombosit fonksiyonlarını etkilediği bilinen bir ajana maruz kalmamış olmasına özen gösterildi. Çalışma için, Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Kurulu'ndan B.30.2.MAR.0.01.02/AEK/983 sayı ile onay alınmıştır. Deneylerde kullanılan kimyasallar Sigma (St. Louis, MO, USA) ve Merck (Darmstadt, Germany) firmasının ürünleridir.

Trombositlerin ayrılması
Çalışmamızda, trombositler aferez yöntemi ayrıldıktan sonra 5000 rpm'de 15 dakika 22ºC ‘de santrifüj edilerek çöktürüldü. Çöken trombositler Tris-NaCl-EDTA (0.03 M Tris, 0.12 M NaCl, pH: 7.4; 5 mM EDTA, 1 U/ml apiraz içeren) tamponu ile süspande edilerek yıkandı. Santrifüj sonrası tamponda (0.03 M Tris; 0.12 M NaCl, 5mM glukoz, pH:7.4) süspande edilerek analizler için kullanıldı.

GGT aktivitesinin inhibisyonu
GGT aktivitesini inhibe etmek için GGT'nin geri dönüşümsüz inhibitörü olan akivisin ve spesifik geri dönüşümlü yarışmalı inhibitörü olan L-serin/borik asit karışımı (SBC) olmak üzere etki mekanizmaları farklı iki inhibitör kullanıldı[1]. İnhibitörler, 500 μM akivisin veya SBC (5 mM L-serin/10mM borik asit) 1ml Tris-NaCI tamponu ile süspande edilmiş trombositlere ilave edilerek 37 °C'de 15 dakika bekletildi. İnkübasyon sonrası örneklerde GGT aktivitesi tayin edilerek[10] inhibisyon oranları belirlendi. GGT aktivitesinin tayini için substrat olarak gama-glutamil p-nitroanilid kullanıldı. Reaksiyon sonunda açığa çıkan p-nitroanilinin verdiği renk 405 nm'de spektrofotometrede okundu ve GGT aktivitesinin inhibisyon oranı % inhibisyon olarak verildi.

Sisteinilglisin düzeylerinin belirlenmesi
İnhibitör uygulanan ve uygulanmayan örneklerde GGT aktivitesi sonucu açığa çıkan sisteinilglisin düzeyleri belirlendi[11]. Yöntemin esası tiyol gruplarına karşı seçici özelliği olan floresan bir madde ile (7-floro 2-benzo 2-okso 1,3-diazol 4-sülfonat, SBDF) ile tiyol gruplarının türevlendirilmesidir. Bu amaçla, 50 μL örnek 25 μL fosfat tamponu (PBS, pH 7.4) ve 1 mM ditiyotreitol (DTT) ile 30 dakika oda ısısında inkübe edildi. Daha sonra örneklerin proteinleri trikloro asetik asit (TCA) ile çöktürüldü ve üst fazları alındı. Üst fazdan alınan 50 μL örnek üzerine 1.55 M NaOH ve 0.125 M borat tamponu (pH:9.5) ilave edildi. Karışıma SBDF (1 g/L) ilave edilerek 60 ºC'de 60 dakika bekletildi. Daha sonra 10 μL örnek floresan detektörlü (385 nm eksitasyon, 515 nm emisyon) ve 5 μm Kromasil C18 kolon (15cm×4.6 mm, Hi Chrom, Berkshire, UK) taşıyan HPLC (Agilent, Mississauga, Canada) sistemine uygulandı. Mobil faz olarak 30 mL/L metanol içeren asetik asit-asetat tamponu (0.1 mol/L, pH 5.5) kullanıldı. Kromatografi 0.7 ml/dakika akış hızı ve 29 ºC sıcaklık değerlerinde yapıldı. Standart olarak ticari sistein, sisteinilglisin ve GSH kullanıldı. Standartlar kolona ayrı ayrı ve karışım halinde enjekte edilerek sisteinilglisin için retansiyon zamanı belirlendi. Sonuçlar μM sisteinilglisin olarak ifade edildi.

Oksidatif parametreler için yapılan inkübasyonlar
Trombositler 5 mM glukoz içeren Tris-NaCl (0.03 M Tris, 0.12 M NaCl) tamponu içinde süspande edildi ve 1 ml'lik trombosit süspansiyonları hazırlandı. GGT aktivitesini uyarmak için fizyolojik substratı olan GSH (2.5 mM) ve akseptör glisilglisin (glygly, 25 mM) kullanıldı. Demir kaynağı olarak FeCI3 (150 μM, nitroasetik asit (NTA) ile komplekslenmiş) kullanıldı. Ortama GGT inhibitörleri ilave edilerek ve edilmeden inkübasyonlar yapıldı. Gruplar (tüm gruplar için n:12) aşağıdaki şekilde oluşturuldu:

1. Kontrol grubu (trombosit+tampon)
2. GSH-gly-gly grubu (trombosit+GSH+glygly)
3. Fe+GSH-glygly grubu (trombosit +demir (III)+GSH+glygly
4. Fe+ SBC+GSH-glygly (trombosit+ demir (III)+SBC+GSH+glygly)
5. Fe+Ac (akivisin)+GSH-glygly (trombosit+demir (III)+akivisin+GSH+glygly)

GGT inhibitörleri (500 μM akivisin, 5/10 mM SBC) inkübasyon ortamına 15 dakika önceden ilave edildi. İnhibitör içermeyen gruplara aynı hacimde tampon ilave edilerek bekletildi. Tüm ajanların ilavesinden sonra 37°C de 45 dakika inkübasyon sonrası trombositler 1200xg'de 10 dakika santrifüj edildi. Çöken trombositler tamponda süspande edildi ve sonikasyonla patlatılarak analizler için kullanıldı.

Lipid peroksidasyonu (LPO), protein oksidasyonu ve GSH düzeylerinin belirlenmesi
Trombosit LPO düzeyleri Beuge ve Aust'un yöntemi ile belirlendi[12]. Lipid peroksidasyonunun son ürünlerinden biri olan malondialdehit (MDA) tiyobarbitürik asit (TBA) ile reaksiyona girerek 532 nm'de maksimum absorbans veren renkli bir bileşik oluşturur. Oluşan bu bileşiğin miktarı MDA ile doğru orantılıdır. Sonuçlar standart grafik kullanılarak nmol MDA/mg protein olarak ifade edildi.

Protein oksidasyonu, protein karbonil içeriklerinin (PCO) tayini ile belirlendi. Trombosit karbonil içeriğinin ölçülmesinde Levine ve ark[13] yöntemi esas alındı. Bu yöntemin prensibi, protein karbonil grupları ile 2,4 dinitrofenil hidrazinin (DNPH) reaksiyonu sonucu oluşan kararlı hidrazon bileşiklerinin 360 nm'de spektrofotometrik olarak ölçülmesi esasına dayanır. Sonuçlar ekstinksiyon katsayısı (2200 M-1cm-1) kullanılarak nmol/mg protein olarak ifade edildi.

Trombositlerde GSH düzeyleri Mergel ve Ark[14] yöntemine göre yapıldı. Bu yöntemde, hafif alkali ortamda, 5,5 ditiyobis 2-nitrobenzoik asit (DTNB, Ellman reaktifi), ortamdaki alifatik tiyol bileşikleriyle tepkimeye girer. Tiyol başına oluşan, p-nitrofenol miktarı 412 nm'de spektrofotometrik olarak ölçüldü. Sonuçlar standart olarak GSH (5μg/ml -30μg/ml) kullanılarak hesaplandı ve μg/ml olarak ifade edildi.

Kaspaz-3 düzeylerinin ölçülmesi
Kaspaz-3 akitivitesi Chemicon kazpaz-3 kolorimetrik ölçüm kiti (Chemicon, Temecula, CA, USA, Kat. No: APT165) kullanılarak yapıldı. Yöntemin prensibi kaspaz-3'ün substratı olan N-Asetil-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilid'den (Ac-DEVDpNA) kromofor p-nitroanilinin (pNA) serbestleşmesinin spektrofotometrik olarak ölçümü esasına dayanmaktadır. Kaspaz-3'ü kaspaz-3 benzeri aktivite gösteren enzimlerden ayırt edebilmek için kaspaz 3'ün spesifik inhibitörü olan N-Asetil-Asp-Glu-Val-Asp-CHO (Ac-DEVD-CHO) kullanılarak da ölçümler yapıldı. Reaksiyon sonunda serbestleşen pNA'nın absorbansı ELISA okuyucusu (Thermo, Multiskan EX, Vantaa, Finland) kullanılarak 405 nm'de ölçüldü ve sonuçlar 1 saatlik inkübasyon sonucu açığa çıkan nmol pNA/mg protein olarak ifade edildi.

Örneklerin protein içerikleri Bradford yöntemine göre (15) tayin edildi.

Trombosit PS translokasyonunun ölçülmesi
PS'nin hücre membranının iç yüzeyinden membranın dış yüzeyine hareketinin ölçümü için kapaklı konik tipli polipropilen tüpler kullanıldı. Ölçüm akım sitometresinde (EPICS XLMCL, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) yapıldı. Öncelikle, trombosit örnekleri tampon ile süspande edildi. 100 μl'lik trombosit örnekleri alındı. İnhibitör ilave edilecek gruplara akivisin veya SBC ilave edilerek 15 dakika ön inkübasyon yapıldı. Daha sonra GGT'nin substratları olan GSH (2.5 mmol/L), glisilglisin (25 mmol/L) ve FeCl3 (150 μM) ilave edilerek karışım reaksiyona girmesi için 45 dakika 37 ºC'de bekletildi. İnkübasyon sonrasında her örnek tüpü üzerine floresein izotiosiyanat (FITC) ile işaretlenmiş anneksin-V (fosfolipidlere bağlanan protein, 25 μg/ml) eklenerek 10 dakika soğuk ortamda karanlıkta bekletildi. Üzerine 100 μl bağlama tamponu (10 mM HEPES/NaOH pH:7.4; 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2 içeren) eklenip akım sitometrisinde ölçüm yapıldı.

CaliBrite boncuklar (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) günlük kalite kontrolü için kullanıldı. Her tüpte 50.000 hücre sayıldı. Trombositlerin tespitinde FITC işaretli CD41a kullanıldı. Trombosit örnekleri akım sitometresinden geçirilirken FSCLog (Log. Forward Scatter: Boyut) ve SSCLog (Log. Side Scatter: granülarite) oranlarına göre trombositler bir kapı içine alınarak kontamine olan diğer kan hücrelerinden ayrıldılar. Hücre yüzeyine PS'nin hareketi ile floresan bir madde olan FITC ile işaretlenmiş anneksin-V ticari kit (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA, Kat. No:556547) kullanılarak anneksin-V pozitifliği gösteren apoptotik/aktive hücreler saptandı. Sonuçlar anneksin-V bağlanma yüzdeleri olarak verildi.

İstatistik Analiz
Veriler, SPSS (version 11.5, Chicago, IL, USA) programı kullanılarak değerlendirildi. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Gruplar arasındaki istatistiksel karşılaştırmalar ‘'repeated measures ANOVA'' ve onu izleyen “Student- Newman Keuls'' testi ile değerlendirilmiştir. Anlamlılık düzeyi p<0.05 olarak kabul edilmiştir.

Results

GGT aktivitesinin inhibisyonu
İnhibisyon çalışmaları sonucu GGT aktivitesinin 500 μM akivisin ile % 90±5.6 oranında 5/10 mM SBC ile %92± 6.8 oranında inhibe olduğu belirlendi. Şekil 1 ve 2'de görüldüğü gibi GGT aktivitesinin inhibe edildiği örneklerde sisteinilglisin düzeylerinin inhibe edilmeyen örneklere kıyasla istatistiksel olarak anlamlı düzeyde azaldığı gözlendi (p<0.001).

ŞEKİL 1: İnkübasyon ortamında oluşan sisteinilglisin düzeylerinin HPLC ile ölçümüne ait kromatogram örnekleri. a) standart karışım (sistein, sisteinilglisin, GSH) b) GSH-glygly grubu c) SBC+GSH-glygly grubuna ait kromatogram.

ŞEKİL 2: İnkübasyon ortamında oluşan sisteinilglisin düzeyleri (Ac: Akivisin, SBC: L-serin-borik asit karışımı, ***p<0.001, kontrole göre anlamlı; +++p<0.001, GSHglygly grubuna göre).

LPO, PCO ve GSH düzeyleri
GGT aktivitesinin GSH ile uyarılması kontrole göre trombosit MDA düzeylerinde ve PCO içeriklerinde anlamlı bir değişikliğe neden olmadı (Şekil 3a, 3b). Ancak demir(III) varlığında, GSH-glygly ile GGT aktivitesinin uyarılması trombosit MDA düzeylerini ve PCO içeriklerini, kontrol grubuna ve sadece GSH-glygly uygulanan grubu göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artırdı (p<0.001, p<0.05, sırasıyla). GGT aktivitesinin her iki inhibitörle de inhibisyonu trombosit MDA düzeylerinde Fe-GSH-glygly grubuna göre anlamlı azalmaya neden oldu (p<0.05, p<0.01 sırasıyla). İnhibitör olarak SBC kullanılan grupta PCO düzeyleri azalırken (p<0.01) akivisin, PCO düzeylerinde anlamlı değişikliğe neden olmadı.

ŞEKİL 3: Trombosit malondialdehit (MDA) düzeyleri (a) (** p<0.01, GSH-glygly ve kontrol grubuna göre; +p<0.05, ++p<0.01, Fe+GSH-glygly grubuna göre ) ve protein karbonil (PCO) içerikleri (b) (*p<0.05, GSH-glygly ve kontrol grubuna göre; ++p<0.01, Fe+GSH-glygly grubuna göre).

Trombosit GSH içerikleri ortamda demir yokken GGT aktivitesinin GSH ile uyarılması sonucu kontrol grubuna göre anlamlı olarak artarken (p<0.001), demir varlığında kontrol düzeylerinde kalmıştır. Demir varlığında GGT aktivitesinin her iki inhibitörle inhibisyonu ile GSH düzeyleri Fe-GSH-glygly grubuna göre artış gösterdi (p<0.001, Şekil 4a).

ŞEKİL 4: Trombosit indirgenmiş glutatyon (GSH) düzeyleri (a)(# p<0.001, kontrol grubuna göre; ***p<0.001, GSH-glygly grubuna göre; +++p<0.001, Fe+GSHglygly grubuna göre). Trombosit kaspaz-3 aktivitesi (b) 1 saat inkübasyon sonrası salınan p-nitroanilin (pNA) düzeyleri ile ölçüldü (gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlılık gözlenmemiştir).

Trombosit kaspaz-3 düzeyleri
Trombosit GGT aktivitesinin demir varlığında trombosit apoptozuna etkisini incelemek amacıyla bir saatlik inkübasyon sonrası kaspaz-3 düzeyleri belirlendi. Ortamda demir bulunmadan GGT aktivitesinin uyarılması kontrol grubuna göre anlamlı değişikliğe neden olmazken demir varlığında GGT aktivitesinin uyarılması kaspaz-3 düzeylerinde düşük düzeyde bir azalmaya neden oldu. Ancak bu azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. GGT aktivitesinin inhibisyonu (her iki inhibitörle de) istatistiksel olarak anlamlı değişikliklere neden olmadı (Şekil 4b).

PS Translokasyonu
Trombositler için aktivasyon/apoptoz göstergesi olan fosfatidil serin translokasyonu FITC işaretli anneksin-V kullanılarak akım sitometresinde ölçüldü. Demir varlığında GGT aktivitesinin uyarılması trombositlerde erken aktivasyon/apoptozda PS translokasyonunun artmasına neden olurken (p<0.05), GGT'nin akivisin ve SBC ile inhibisyonu PS cevabının azalmasına neden oldu (p<0.001, p<0.01, sırasıyla). Aktivasyon/ apoptozun geç fazında ise GGT aktivitesinin uyarılması ve inhibe edilmesi trombosit PS cevabında değişikliğe neden olmadı (Şekil 5, Şekil 6).

ŞEKİL 5: Akım sitometresinde elde edilen fosfatidilserin (PS) translokasyonuna ait örnek grafikler: (a); kapı içine alınmış trombositler, (b); trombositlerin akım sitometresinden elde edilen dağılım grafiği.

ŞEKİL 6: Anneksin-V bağlanma yüzdeleri üzerinden trombosit fosfoatidilserin (PS) translokasyonu (1. sütunlar erken, 2. sütunlar geç apoptoz/aktivasyon fazlarını temsil etmektedir. **p<0.01, GSH-glygly grubuna göre; ++p<0.01, +++p<0.001 Fe+GSH-glygly grubuna göre).

Reference

1) Yaman A. Gamma-glutamiltransferaz. Biyokimya Dergisi, 4: 27-37, 1997.

2) Whitfield JB. Gamma glutamyl transferase. Crit Rev Clin Lab Sci, 38: 263-355, 2001.

3) Krötz F, Sohn HY, Pohl U. Reactive oxygen species: players in the platelet game. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 24: 1988–96, 2004.

4) Freedman JE. Oxidative Stress and Platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 28: 11-16. 2008.

5) Paolicchi A, Tongiani R, Tonarelli P, Comporti M, Pompella A. Gamma-glutamyl transpeptidase-dependent lipid peroxidation in isolated hepatocytes and HepG2 hepatoma cells. Free Radic Biol Med, 22: 853-860, 1997.

6) Dominici S, Valentini M, Maellaro E, Del Bello B, Paolicchi A, Lorenzini E, Tongiani R, Comporti M, Pompella A. Redox modulation of cell surface protein thiols in U937 lymphoma cells: the role of gamma-glutamyl transpeptidase-dependent H2O2 production and S-thiolation. Free Radic Biol Med, 27: 623-635,1999.

7) Spear N, Aust SD. Thiol-mediated NTA-Fe (III) reduction and lipid peroxidation. Arch Biochem Biophys, 312: 198-202,1994.

8) Pieri L, Dominici S, Del Bello B, Maellaro E, Comporti M, Paolicchi A, Pompella A. Redox modulation of protein kinase/phosphatase balance in melanoma cells: the role of endogenous and gamma-glutamyltransferasedependent H2O2 production. Biochim Biophys Acta, 1621: 76-83, 2003.

9) Li J, Xia Y, Bernito AM, Coburn JP, Kuter DJ. The mechanism of apoptosis in human platelets during storage. Transfusion, 40: 1320-329, 2000.

10) Szasz G. A kinetic photometric method for serum gamma-glutamyl transpeptidase. Clin Chem, 15: 124- 136, 1969.

11) Pfeiffer CM, Huff DL, Gunter EW. Rapid and accurate HPLC assay for plasma total homocysteine and cysteine in a clinical laboratory setting. Clin Chem, 45: 290-292, 1999.

12) Buege JA, Aust SD. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol, 52: 302-310, 1978.

13) Levine RL, Garland D, Oliver CN, Amici A, Climent I, Lenz AG, Ahn BW, Shaltiel S, Stadtman ER. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods Enzymol, 186: 464-478, 1990.

14) Mergel D, Andermann G, Andermann C. Simultaneous spectrophotometric determination of oxidized and reduced glutathione in human and rabbit red cells. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 1: 277-283, 1979.

15) Bradford MM. A rapid and sensitive method for quantititation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal Biochem, 7: 248- 254, 1976.

16) Stark AA, Russell JJ, Langenbach R, Pagano DA, Zeiger E, Huberman E. Localization of oxidative damage by a glutathione-gamma-glutamyl transpeptidase system in preneoplastic lesions in sections of livers from carcinogen-treated rats. Carcinogenesis, 15: 343-348, 1994.

17) Enoiu M, Aberkane H, Salazar JF, Leroy P, Groffen J, Siest G, Wellman M. Evidence fort he pro-oxidant effect of gamma-glutamyltranspeptidase-related enzyme. Free Radic Biol Med, 29: 825-833, 2000.

18) Paolicchi A, Minotti G, Tonarelli P, Tongiani R, De Cesare D, Mezzetti A, Dominici S, Comporti M, Pompella A. Gamma-glutamyl transpeptidase-dependent iron reduction and LDL oxidation-a potential mechanism in atherosclerosis. J Investig Med, 47:151-160, 1999.

19) Aberkane H, Stoltz JF, Galteau MM, Wellman M. Erythrocytes as targets for gamma-glutamyltranspeptidase initiated pro-oxidant reaction. Eur J Haematol, 68: 262- 71, 2002.

20) Sener A, Özsavcı D, Yanıkkaya-Demirel G, Aksoy H, Oba R, Uras F, Yardımcı T. The role of gammaglutamyltransferase (GGT) activity on early platelet apoptotic process. Turk J Hematol, 22:272, 2005.

21) Sener A, Ozsavci D, Bingol-Ozakpinar O, Cevik O, Yanikkaya-Demirel G, Yardimci T. Oxidized-LDL and Fe3+/ascorbic acid-induced oxidative modifications and phosphatidylserine exposure in human platelets are reduced by melatonin. Folia Biol (Praha), 55:45-52, 2009.

22) Law DA, Nannizzi-Alaimo L, Phillips DR. Outside-in integrin signal transduction. Alpha IIb beta 3-(GP IIb/IIIa) tyrosine phosphorylation induced by platelet aggregation. J Biol Chem, 271: 10811-10815, 1996

23) Essex DW, Li M, Feinman RD, Miller A. Platelet surface glutathione reductase-like activity. Blood, 104: 1383-1385 2004.

24) Essex DW. Redox control of platelet function. Antioxid Redox Signal, 11:1191-1225, 2009.

25) Essex DW, Li M. Redox control of platelet aggregation. Biochemistry, 42:129-136, 2003.

26) Sliskovic I, Mutus B. Reversible inhibition of caspase-3 activity by iron(III):potential role in phsiological control of apoptosis. FEBS Lett, 580: 2233-37, 2006.

27) Cohen Z, Davis-Gorman G, McDonagh PF, Ritter L. Caspase inhibition of platelet activation. Blood Coagul Fibrinolysis, 19: 305-309, 2008.

28) Trombosit apoptozu ve aktivasyonu arasındaki ilişki. Turk J Hematol, 24: 171-176, 2007.

29) Sener A, Ozsavci D, Oba R, Demirel GY, Uras F, Yardimci KT. Do platelet apoptosis, activation, aggregation, lipid peroxidation and platelet-leukocyte aggregate formation occur simultaneously in hyperlipidemia? Clin Biochem, 38: 1081-1087, 2005.

30) Leytin V, Allen DJ, Mutlu A, Mykhaylov S, Lyubimov E, Freedman J. Platelet activation and apoptosis are different phenomena: evidence from the sequential dynamics and the magnitude of responses during platelet storage. Br J Haematol, 142: 494-497, 2008.

31) Prakash M. Role of non-transferrin-bound iron in chronic renal failure and other disease conditions. Ind J Nephrol, 17: 188-93, 2007.

32) Halliwell B, Gutteridge JMC. The antioxidants of human extracellular fluids. Arch Biochem Biophys, 280: 1-8, 1990.

33) Lamb DJ, Leake DS. Iron released from transferrin at acidic pH can catalyse the oxidation of low density lipoprotein. FEBS Lett, 352: 15-18, 1994.

34) Abdalla DS, Campa A, Monteiro HP. Low density lipoprotein oxidation by stimulated neutrophils and ferritin. Atherosclerosis, 97: 149-159, 1992.

35) Van Campenhout A, Van Campenhout CM, Lagrou AR, Manuel-y-Keenoy B. Transferrin modifications and lipid peroxidation: implications in diabetes mellitus. Free Radic Res, 37:1069-1077, 2003.

Marmara University