Editor-in-Chief Hatice Kübra Elçioğlu Vice Editors Levent Kabasakal Esra Tatar Online ISSN 2630-6344 Publisher Marmara University Frequency Bimonthly (Six issues / year) Abbreviation J.Res.Pharm. Former Name Marmara Pharmaceutical Journal
Journal of Research in Pharmacy 2011 , Vol 15 , Num 2
Serum Ochratoxin A Levels in Geriatric Population
Belma Giray, Pınar Erkekoğlu, Suna Sabuncuoğlu, Sevtap Aydın, Gönül Şahin
1Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, F.Toksikoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye DOI : 10.12991/201115433

Summary

Okratoksin A (OTA) en yaygın rastlanan mikotoksinlerden biridir. Çalışılan tüm hayvan türlerinde nefrotoksik olduğu gösterilmiş, immünosüpresif, hepatotoksik, teratojenik ve genotoksik etkilerinin bulunduğu bildirilmiştir. Birçok ülkede çeşitli gıdalarda OTA düzeyleri belirlenmiş olmakla birlikte, insanlardaki düzeylerine ilişkin sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmanın amacı, geriatrik popülasyonda serum OTA düzeylerini tespit etmek ve bu düzeylerin cinsiyet, beslenme alışkanlıkları ve vücut kitle indeksi ile ilişkisini belirlemektir. Akdeniz ve İç Anadolu Bölgelerinde yaşayan yaşlı bireylerden (yaş ortalaması: 72.8 ± 5.6)” geriatrik çalışma grubu (n=30)”oluşturulmuş ve serum OTA düzeyleri enzim immünoassay yöntemi ile tayin edilmiştir. Çalışma grubunda yer alan kadınlarda (0.601 ± 0.012 ng/ ml) erkeklere (0.335 ± 0.096 ng/ml) oranla yaklaşık 2 kat daha yüksek serum OTA düzeyleri tespit edilmiştir (p>0.05). İç Anadolu Bölgesinde yaşayan bireylerdeki serum OTA düzeylerinin Akdeniz Bölgesinde yaşayanlara oranla yaklaşık 2.5 kat daha yüksek olduğu bulunmuştur (p<0.05). Bu farklar, cinsiyet ve bölgeler arasındaki değişik beslenme alışkanlıklarından ileri gelebilir. Diğer taraftan, tüm çalışma gruplarında günlük OTA alım düzeyleri düzenleyici otorite tarafından kabul edilen tolere edilebilir günlük alım düzeylerinin altında hesaplanmıştır. Gıdalar yoluyla OTA ile birlikte farklı mikotoksinlere temasın da söz konusu olabileceği ve OTA dahil maruz kalınan tüm mikotoksinlerin toplam etkilerine bağlı toksisitenin özellikle geriatrik popülasyonda önemli olabileceği göz ardı edilmemelidir.

Introduction

Mikotoksinler, uygun nem ve ısı koşullarında gıda maddelerinde üreyebilen küflerin oluşturduğu toksik metabolitlerdir. Farklı gıdalar aracılığıyla büyük ölçüde temas edilebilen mikotoksinlerin insan sağlığı üzerinde son derece önemli toksik etkileri bulunmaktadır. Bu toksinler, günümüzde halk sağlığını tehdit etmenin yanı sıra ekonomide de ciddi kayıplara neden olmaktadır. Aflatoksin, okratoksin, trikotesen, patulin ve zearalenonlar başlıca mikotoksinler arasında sıralanabilir[1,2].

Okratoksin A (OTA), Aspergillus ve Penicillium türü mantarlar tarafından üretilen ve çeşitli tahıl türleri başta olmak üzere farklı gıdalarda (süt ve süt ürünleri, baklagiller, kahve, taze ve kuru üzüm, olgunlaşmakta olan ve kurutulmuş meyvalar, şarap) tespit edilmiş bir okratoksin türüdür. Ayrıca, bilhassa domuz eti, diğer hayvanların etleri ile organları ve anne sütünde de bulunmaktadır[1-5].

Deney hayvanlarında nefrotoksik etkisi kanıtlanmış ve güçlü bir renal karsinojen olduğu belirlenmiştir[3-5]. İnsanların OTA’ya teması, doğrudan mantar türünün geliştiği gıdaların tüketimiyle olduğu gibi, bunları tüketen hayvan ürünlerinin alınmasıyla da olmaktadır. Okratoksinlerin oluşturdukları klinik tabloya okratoksikoz denir. OTA’nın yaptığı renal lezyonlar, proksimal tübülün dejenerasyonu dahil, renal kortekste interstisyel fibrozis, glomerülün hiyalinizasyonu ve tübüler epitelin atrofisi ile birliktedir. OTA, ilk olarak proksimal tübüllerin epitel hücrelerinde böbrek büyüklüğünü azaltmadan dejeneratif değişikliklere neden olur ve bu hücrelerde daha sonra görülen apoptotik tipte lezyonun da nedenidir. Ayrıca, OTA maruziyeti böbrek korteksinin intertisyumunda eosinofilik, aselüler oluşumlara neden olur. Kronik maruziyette ise böbrek büyüklüğü azalır ve enflamatuar hücreler görülmeden difüz kortikal fibröz gelişir[4,6].

OTA’nın immünosüpresif, hepatotoksik, nefrotoksik, teratojenik, apoptoz indükleyicisi, genotoksik ve lipit peroksidasyonu artırıcı etkileri olduğu gösterilmiştir[7,8]. DNA kırılmaları, protein sentezinin inhibisyonu ve glikoneogenez, mitokondride oksidatif fosforilasyonun bozulması ve kanın pıhtılaşmasının engellenmesine neden olmasıyla insan sağlığı için büyük önem taşımaktadır. Fatal doz maruziyeti ile renal tübül nekrozu ve periportal karaciğer hücrelerinde pek çok patolojik değişiklik gözlenmiştir[6,9]. OTA, Uluslararası Kanser Araştırma Enstitüsü (IARC) tarafından “Grup IIB” muhtemel karsinojen olarak sınıflandırılmıştır[5]. Dolaylı karsinojen mekanizması aracılığıyla epigenetik karsinojen olarak da adlandırılmaktadır. Ancak aynı zamanda DNA’ya doğrudan bağlanabilmesi nedeniyle doğrudan karsinojen olarak kabul edilmektedir[4,5].

Çeşitli gıda ürünlerinde OTA düzeylerini tayin eden çok sayıda çalışma bulunmakla birlikte, insanlardaki düzeyin tayin edildiği çalışmalar sınırlıdır. Özellikle sağlıklı bireylerdeki bazal düzeylerin tespit edildiği ve yaş ile ilişkisinin değerlendirildiği çalışmalar az sayıdadır, genellikle yetişkin popülasyonda yapılmıştır[10-16]. Palli ve ark.[13] tarafından İtalya’da sağlıklı yetişkinlerde (yaş aralığı 35-64) yapılan bir çalışmada, serum OTA örnekleri 0.2- 1.0 ng/ml olarak belirlenmiş; erkeklerde tayin edilen serum OTA düzeylerinin kadınlara oranla anlamlı ölçüde yüksek bulunduğu rapor edilmiştir. Hırvatistan’da yapılan bir diğer çalışmada, en yüksek plazma OTA düzeyinin erişkin bir popülasyonda, yaz döneminde 0.39 ng/ml olarak saptandığı bildirilmiştir[16]. Assaf ve ark.’nın Lübnan’da yapmış oldukları çalışmada ortalama plazma OTA düzeyi 0.17 ng/ml olarak tespit edilmiş; cinsiyet ve yaş ile OTA düzeylerinde bir farklılık gözlenmediği rapor edilmiştir[14]. Diğer taraftan, Çek Cumhuriyetinde yapılan bir diğer çalışmada ise 60 yaşın üzerindeki kadınlarda 1 ng/ml’nin üstünde OTA tespit edilme oranının daha fazla olduğu rapor edilmiştir[12].

Ülkemizde ise bu doğrultuda yapılmış bir çalışmaya rastlanmamıştır Bu bilgiler ışığında sunulan çalışmanın konusunu, yaşlı popülasyonda serum OTA düzeylerinin saptanması ve cinsiyet, beslenme alışkanlığı, vücut kitle indeksi ile birlikte değerlendirilmesi oluşturmaktadır.

Methods

Çalışma Grubu
Türkiye’nin farklı bölgelerinde yaşayan (Akdeniz, n=16; İç Anadolu: n=14), yaş ortalaması 65 ile 95 arasında değişen (72.8 ± 5.6) bireylerden basit rastgele örnekleme yöntemi ile “geriatrik çalışma grubu (n=30)” oluşturulmuştur. Boy, kilo, beslenme alışkanlıkları mevcut kronik hastalıkları ve ailesel hastalık öyküsü standart bir anket uygulanarak alınmıştır. Ankette yer alan ve gıdaların ne sıklıkta tüketildiği ile bir seferde tüketilen gıda miktarına yönelik sorular ile beslenme alışkanlığına ilişkin bilgi elde edilmiştir. Çalışmaya dahil edilen yaşlı bireylerin herhangi bir karaciğer veya böbrek rahatsızlığının olmadığı da yapılan anket çalışması ile doğrulanmıştır. Her bir gönüllüden 10 ml venöz kan örneği toplanmış, 800 xg’de 15 dakika santrifüj edilerek serum örnekleri ayrılmış ve analize dek –20°C’lik derin dondurucuda saklanmıştır. Bireylerden örnek toplanması yaz döneminde (Haziran-Temmuz aylarında) gerçekleştirilmiştir.

Çalışma, “Helsinki Deklerasyonu”na göre Hacettepe Üniversitesi Etik Kurulu’nca onaylanmıştır. Tüm bireylerin gönüllü olarak kan verdiklerini belirten imzalı aydınlatılmış onam formları kan örnekleri toplanmadan önce alınmıştır.

Vücut kitle indeksinin hesaplanması
Çalışma grubunda yer alan yaşlı bireylerden elde edilen bilgiler ışığında kilo ve boyları kaydedilmiş ve vücut kitle indeksleri (VKİ) aşağıda belirtilen şekilde hesaplanmıştır (17):

VKİ = Vücut Ağırlığı (kg)/ (Boy)2 (m)

Okratoksin A düzeylerinin tayini
Çalışma grubunda yer alan bireylerden alınan serum örnekleri, OTA düzeylerinin belirlenmesi amacıyla RIDASCREEN OTA Enzim İmmünoassay prosedürüne göre ekstre edilmiştir. Ekstraksiyonu takiben serum OTA düzeyleri RIDASCREEN OTA ELISA kitleri (Darmstadt, Almanya) kullanarak belirlenmiştir. Kullanılan OTA standartları 25-2025 ng/L arasındadır ve yöntemin deteksiyon limiti 25 ng/L’dir. Geri kazanım deneyleri serum örneklerine 300 ng/L OTA eklenerek gerçekleştirilmiş ve geri kazanım oranı %100.79 ± 3.9 olarak belirlenmiştir.

Günlük okratoksin A alım düzeylerinin belirlenmesi
Günlük OTA alım düzeyleri, OTA plazma/serum klerensi, vücuttaki biyoyararlanımı ve serum OTA düzeylerinden hareketle, aşağıda belirtilen hesaplama yöntemine göre hesaplanmıştır (18).

k0 = Clpx Cp/ A

k0= Cp x 1.34

k0= Günlük OTA Alım Düzeyi (ng/kg vücut ağırlığı/ gün)

Clp: OTA plazma klerensi= 0.67 ml/kg vücut ağırlığı/gün

Cp: OTA serum konsantrasyonu (ng/ml)

A: OTA biyoyararlanımı= 0.5

İstatistiksel Analiz
Gruplar arası farkların önem kontrolleri, ANOVA tek yönlü varyans analizi ve Student’s t-testi uygulanarak test edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart hata (SEM) olarak verilmiştir. Değişkenler arasındaki korelasyonlar, normal dağılım gösteren değişkenler için «Pearson», normal dağılım göstermeyen değişkenler için «Spearman” korelasyon yöntemi ile incelenmiştir.

Results

Akdeniz ve İç Anadolu Bölgesinde yaşayan ve yaş ortalaması 72.8 ± 5.6 olan 30 kişiden kan örnekleri toplanmış ve serum OTA düzeyleri tayin edilmiştir. Geriatrik çalışma grubunda yer alan bireylere ait demografik veriler Tablo 1’de görülmektedir. Çalışma grubunda yer alan kadın ve erkek sayısı eşittir (n=15) ve her iki grup arasında yaş, kilo ve VKI yönünden istatistiksel olarak önemli bir fark bulunmamıştır (p>0.05). Boy açısından ise gruplar arasında anlamlı bir fark mevcuttur (p<0.05). Bireylerde mevcut hastalıkların dağılımı ve beslenmelerine ilişkin bilgi Şekil 1’de verilmiştir.

ŞEKİL 1: Geriatrik çalışma grubunda mevcut hastalıkların dağılımı KVS: Kardiyovasküler sistem

TABLO 1: Geriatrik Çalışma Grubuna ait Demografik Bilgiler

Beslenme alışkanlıkları yönünden çalışma grubu incelendiğinde, özellikle sebze ve meyve tüketimi yönünden fark olmadığı, tüm çalışma grubunun bu besinleri tükettiği görülmüştür (Şekil. 2 ve Şekil 3). İç Anadolu Bölgesi’nde kırmızı et ve balık tüketiminin Akdeniz Bölgesi’ne gore daha az olduğu, daha yüksek oranda tavuk tercih edildiği tespit edilmiştir. Tahıl ve tahıl ürünlerinin alım oranı da özellikle İç Anadolu Bölgesi’nde yüksektir.

ŞEKİL 2: Akdeniz Bölgesi’ndeki geriatrik çalışma grubunun beslenme alışkanlıkları Gıda gruplarının bireylerin günlük diyetinde yer alıp almadığı ifade edilmektedir.

ŞEKİL 3: İç Anadolu Bölgesi’ndeki geriatrik çalışma grubunun beslenme alışkanlıkları Gıda gruplarının bireylerin günlük diyetinde yer alıp almadığı ifade edilmektedir

Okratoksin A düzeyleri yönünden değerlendirme yapıldığında, serum OTA düzeylerinin erkeklerde 0.335 ± 0.096 ng/ml; kadınlarda 0.601 ± 0.012 ng/ml olduğu, tüm çalışma grubunda da 0.453 ± 0.078 ng/ml olarak belirlendiği görülmektedir (Şekil 4). Ortalama serum OTA düzeyleri minimum, maksimum ve ortanca değerleri ile birlikte Tablo 2’de verilmiştir. Kadınlarda ölçülen düzeyler erkeklere oranla yaklaşık 2 kat fazla olmakla birlikte istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p>0.05). Günlük OTA alım düzeyleri de erkeklerde 0.449 ± 0.129 ng/kg/gün; kadınlarda 0.805 ± 0.160 ng/kg/gün ve tüm çalışma grubunda 0.607 ± 0.105 ng/kg/gün olarak hesaplanmıştır (Tablo 3). Gruplar arası fark istatistiksel olarak önemli bulunmamıştır (p>0.05). Serum OTA konsantrasyonları ve günlük alım düzeyleri ile yaş ve VKI arasındaki ilişkilerin değerlendirilmesi amacıyla korelasyon katsayıları hesaplanmış, ancak istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunamamıştır (OTA konsantrasyonu- VKI için r=-0.047, p>0.05; OTA alım düzeyi- VKI için r=-0.047, p>0.05; OTA konsantrasyonu- yaş için r=0.169, p>0.05; OTA alım düzeyi- yaş için r=0.169, p>0.05).

ŞEKİL 4: Kadın ve Erkeklerde Serum Okratoksin A düzeyleri

TABLO 2: Serum Okratoksin A Düzeyleri

TABLO 3: OTA Günlük Alım Düzeyleri

Ayrıca, Akdeniz ve İç Anadolu Bölgelerinde yaşayan yaşlı bireylerde tayin edilen serum OTA düzeyleri karşılaştırılmış ve İç Anadolu Bölgesinde tayin edilen serum OTA düzeylerinin (0.702 ± 0.097 ng/kg), Akdeniz Bölgesinde tayin edilen ortalama OTA düzeylerinden (0.299 ± 0.122 ng/kg) anlamlı ölçüde yüksek (p<0.05) olduğu belirlenmiştir (Şekil 5). Her iki bölgede hesaplanan günlük alım düzeyleri arasındaki fark da (Akdeniz: 0.400 ± 0.122 ng/kg/gün); İç Anadolu: 0.967 ± 0.137 ng/ kg/gün) istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0.05).

ŞEKİL 5: Geriatrik popülasyonda bölgelere göre Serum Okratoksin A düzeyleri a p<0.05

Reference

1) Bennett JW, Klich M. Mycotoxins. Clin Microbiol Rev 2003;16 (3): 497- 516.

2) Fink-Gremmels J. Mycotoxins: their implications for human and animal health. Vet Q 1999;21 (4): 115-120.

3) Peraica M, Radić B, Lucić A, Pavlović M. Toxic effects of mycotoxins in humans. Bull World Health Organ 1999;77 (9): 754-766.

4) Bayman P, Baker JL. Ochratoxins: a global perspective. Mycopathologia 2006; 162 (3): 215-223.

5) Pfohl-Leszkowicz A, Manderville RA. Ochratoxin A: An overview on toxicity and carcinogenicity in animals and humans. Mol Nutr Food Res 2007;51 (1): 61- 99.

6) Fuchs R, Peraica M. Ochratoxin A in human kidney diseases. Food Addit Contam 2005; 22 Suppl. 1: 53-57.

7) Atroshi F, Biese I, Saloniemi H, Ali-Vehmas T, Saari S, Rizzo A, Veijalainen P. Significance of apoptosis and its relationship to antioxidants after ochratoxin A administration in mice. J Pharm Sci 2000; 3 (3): 281-291.

8) Soyoz M, Özcelik N, Kılınç I, Altuntaş I. The effects of ochratoxin A on lipid peroxidation and antioxidant enzymes: A protective role of melatonin. Cell Biol Toxicol 2004;20 (4): 213-219.

9) Pitt JI. Toxigenic fungi: Which are important. Med Myology 2000; 38 Suppl. 1: 17-22.

10) Gilbert J, Brereton P, MacDonald S. Assessment of dietary exposure to ochratoxin A in the UK using a duplicate diet approach and analysis of urine and plasma samples. Food Addit Contam 2001;18 (12): 1088-1093.

11) Hadlok M. Human ochratoxicosis in Germany updating 1993. In: Human ochratoxicosis and its pathologies. Editors: Creppy EE, Castegnaro M, Dirheimer G, Eurotext. Montrouge. 1993, pp 141-145.

12) Ruprich J, Ostrý V. Study of human exposure to ochratoxin A and assessment of possible sources. Cent Eur J Public Health 1993;1(2): 46-48.

13) Palli D, Miraglia M, Saieva C, Masala G, Cava E, Colatosti M, Corsi AM, Russo A, Brera C. Serum levels of ochratoxin A in healthy adults in Tuscany: correlation with individual characteristics and between repeat measurements. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1999;8(3): 265-269.

14) Assaf H, Betbeder AM, Creppy EE, Pallardy M, Azouri H. Ochratoxin A levels in human plasma and foods in Lebanon. Hum Exp Toxicol 2004; 23(10): 495-501.

15) Burdaspal PA, Legarda TM., Datos sobre la presencia de ochratoxina A en plasma humano en Espana. Alimentaria 1998;292: 103-109.

16) Peraica M, Domijan AM, Matasin M, Lucic A, Radic B, Delas F, Horvat M, Bosanac I, Balija M, Grgicevic D, Variations of ochratoxin A concentration in the blood of healthy populations in some Croatian cities. Arch Toxicol 2001;75(7): 410-414.

17) World Health Organization, The problem of overweight and obesity. In: WHO Technical report series, Obesity: preventing and managing the global epidemic. WHO Press. Geneva. 2000, pp 6-13.

18) Breitholtz A, Olsen M, Dahlbäck A, Hult K. Plasma ochratoxin A levels in three Swedish populations surveyed using an ion-pair HPLC technique. Food Addit Contam 1991;8(2): 183-92.

19) Scott PM. Biomarkers of human exposure to ochratoxin A. Food Addit Contam 2005; 22 Suppl. 1: 99-107.

20) Scott PM, Kanhere SR, Lau BP, Lewis DA, Hayward S, Ryan JJ, Kuiper-Goodman T. Survey of Canadian human blood plasma for ochratoxin A. Food Addit Contam 1998;15(5): 555-562.

21) Ozcelik N, Kosar A, Soysal D, Ochratoxin A in human serum samples collected in Isparta-Turkey from healthy individuals and individuals suffering from different urinary disorder. Toxicol Lett 2001;121(1): 9-13.

22) Sabuncuoğlu S, Erkekoğlu P, Aydın S, Şahin G, Giray B. Seasonal variation in serum ochratoxin levels in healthy subjects living in Mediterranean Region of Turkey. In: Abstract Book of 122nd Annual Meeting and Exposition. AOAC International Press. Dallas, Teksas. 2008, pp. 128.

23) World Health Organization, Ochratoxin A. In: WHO Technical report Series, Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants. WHO Press. Geneva. 2007, pp.169-180.

24) The Nordic Working Group on Food Toxicology and Risk Evaluation. Health evaluation of ochratoxin A in food products. In: Nordiske Seminar-og Arbejdsrapporter 545. Nordic Council of Ministers. Copenhagen. 1991, pp. 1-26.

25) Kuiper-Goodman T. Uncertainties in the risk assessment of three mycotoxins: aflatoxin, ochratoxin, and zearalenone. Can J Physiol Pharmacol 1990;68(7): 1017-1024.

Marmara University